罗氏核酸检测系统的质量控制

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　　[摘要] 病毒核酸检测技术（NAT）是一项直接检测病原体核酸的技术，随着血站核酸检测技术的全面覆盖，质量保证和质量控制已成为核酸检测的灵魂和核心。影响核酸检测质量的因素主要可分为检测前、检测中和检测后三大因素，这些因素又与人员、仪器设备、材料、方法、环境等要素相互作用共同影响着核酸检测的质量。因此，单一因素的控制与质量分析已然无法保证核酸检测质量，需要建立完善的质量管理体系给予全流程控制，这样还可以有效地预防经输血传播病毒性疾病，降低经输血传播病毒的风险。
　　[关键词] 病毒核酸检测;技术质量控制;质量保证
　　[中图分类号] R446.11 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2019）02（c）-0032-03
　　 随着血液核酸检测工作在全国血液系统的全面深入，核酸检测特异性强，灵敏度高，质量体系的建立与完善就显得尤为重要[1]。质量控制的内容涵盖于得出检验结果的所有步骤，包括从标本收集、检测直至报告结果签发的整个检验过程。长沙血液中心自2015年开展核酸血液筛查工作，选用国外诊断试剂罗氏血筛系统，采取6样本混合检测方案，现总结日常工作中对核酸检测工作产生质量影响的关键点，进一步规范检测人员对核酸扩增检测系统的操作，提升检测质量，达到持续改进的目的。
　　1  测定前因素
　　1.1  标本采集
　　 对采集工作人员进行全员培训，先留取酶免管，再留取核酸管，采用低温离心机离心，留样后加盖颠倒混匀8次以上，样本在检测前冷链运输的温度是2～10℃，整个采集过程做好质量监控。
　　1.2  标本接收
　　 血液标本的接收要求：①标本与血液一一对应;②标本质量符合检测项目技术要求，仔细核实标本是否存在凝块、未离心、溶血、乳糜、试管是否破损[2-4]，标本量是否足量等现象，如有上述情况发生，进行相关处理措施以后再进行实验，质量不合格，抗凝剂的种类，采集管的顺序、数量和方法都会影响血液样本中核酸的检出;③标本信息具有可追溯性。
　　1.3  实验室设施、仪器设备
　　 实验室要做好关键仪器设备的维护、校准包括核酸提取系统、扩增判读系统、微量加样枪维护校准。对维修后的加样器、扩增仪的光源、温控系统等设备也要做好故障后的验证工作，对于紫外灯管也要定期监测其辐射强度。我们日常实验时需要特别注重设备的维护：①用75%乙醇重点擦拭Core-Tip金属挡板，并放到正确的位置;②条码夹仅供一次性使用，条码夹与S-tube一一对应，条码夹需放到位;③打開CAP的工程师面板，观察洗液接头1和洗液接头2有没有大颗气泡或管路的接头处空出一段;④观察注射器上端有没有大型气泡颗粒和黑色活塞上有无白色结晶;⑤试剂针针头部有无液滴;⑥SPU的准备（须上机前，上机后反复确认），SPU须放置方向正确，确保每个SPU两边紧贴SPU架，上载仪器前对每个SPU两边分别目测核查，避免用蛮力拍击SPU的盖子（会导致S-tip卡死无法拔出导致机器停机）;⑦K-tip 及K-tube的放置应注意，放置后迅速在Amplilink软件上确认是否有耗材识别错误，K-tip及K-tube架可置于M-P的任意位置，K-tip及K-tube必须满架上载，空架下载于CAP。
　　1.4  理想的试剂和方法
　　 罗氏核酸检测试剂分为检测试剂和对照试剂，试剂盒检测试剂应存放于专用试剂贮存区，以防试剂受到污染。试剂使用前要做好前批号的确认，同时注意比较新旧批号之间变异系数的差异：要注意试剂稳定性：不要冷冻试剂，2～8℃保存 MPX CS1，MPX CS2，MPX CS3和MPX CS4;开瓶有效期为20 d 2～8°C;累计使用时间;COBASR AmpliPrep 仪器中累计使用40 h，连续使用时间：COBASR AmpliPrep 仪器中连续24 h。应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”。
　　1.5  人员培训
　　 “人”是一切工作的核心，针对核酸实验室工作人员的培训活动应该重点进行，严格按照标准操作规程执行，每一位工作人员都要有核酸实验室“无基因”或“无核酸”的概念，防止产生的非特异性扩增结果，各区域的物品及实验记录均为该区专用，不得交叉使用，了解核酸每一步骤制定的目的和意义，强化防治污染的意识。对因个人操作原因导致的实验无效，应纳入人员评估过程，持续改进，增加个人培训力度，同时应该增加人员的外出进修培训机会，学习前沿实用的工作经验来指导实际工作，不断提高工作人员的操作能力及数据分析能力。
　　2  测定中因素
　　2.1  室内质量控制
　　 室内质量控制是指实验室工作人员为了决定当批测定结果的有效性，报告是否能发出而采取的一系列工作。是对实验室测定的即时性评价。核酸检测系统中每一个分析批均要测定一次质控品，在核酸提取中，应带1份已知的弱阳性质控标本，其检测结果是核酸提取和扩增有效性的综合反映，阴性对照无扩增信号，阳性对照扩增循环次数在正常范围之内， 所有样品内标扩增循环信号均在正常范围。将浓度为200 IU/mL、2 000 IU/mL、2 000 IU/mL的质控标准品稀释至接近检测下限的2～5倍[5]，试验前充分混匀，监测实验从加样、核酸提取到扩增的整个过程，室内质控品解冻后最好在72 h内使用完，尽可能保证质控品的稳定性，要求质控品扩增信号在预期范围内，建立室内质控框架，观察质控品的稳定性，对异常出现的质控值，分析其原因，阳性质控样本失控的常见原因有：①核酸提取中的随机误差，如有机溶剂的去除不彻底、核酸提取中的丢失、所用耗材如离心管有 PCR抑制物、标本中扩增抑制物的残留等;②仪器的问题，如扩增仪孔间温度的不均一性、 孔内温度与所示温度的不一致性等;③试剂的问题，如探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率、Taq酶或逆转录酶的失活等[6]。 　　2.2  室间质量评价
　　 室间质量评价主要是将通过实验室质量考评结果的比对，对既定项目检验结果的一致性、准确性进行客观评价，了解检测结果差异，提出针对性改进措施。目前该中心血液核酸检测的室间质评主要是做卫生部、省临检中心室间质评、澳大利亚室间质评提供的相关标本， 每次参加室间质评后都对检测结果做了及时的反馈，根据反馈结果与该室检测结果进行对比，分析该实验室核酸检测结果准确性。
　　3  测定后因素
　　3.1  质量监控指标的建立
　　 实验室质量监控指标的建立符合核酸检测实验室质量保证指南、WS/T496-2017《临床实验室质量指标》、IS015189《医学实验室质量和能力认可准则》等规范的要求。我们实验室目前使用的检测指标主要有核酸和酶免阳性率、混检阳性率、拆分阳性率、室内质控品确认的批次数和失控率、核酸检测设备的故障率、环境监测阳性率及实验无效率和原因分析等[6]，并依据具体情况调整各项监控指标的监测内容，确保实验室各项检测关键点均在监控范围内。
　　3.2  认真审核测定结果，进行无效原因分析
　　 罗氏核酸检测设备提取与扩增的自動化，提取好的核酸会通过中间的自动化连接装置转移到扩增检测系统完成。罗氏核酸检测试剂全部都是试剂盒形式，一方面减少了人为手工操作配置试剂的误差，另一方面增加了对测定结果进行审核的要求，审核结果主要是对异常结果和扩增曲线的分析利用。如内标出现异常，靶标曲线非典型，无核酸结果，汇集与拆分项目不一致，对照品及质控品没达到预期CT值，汇集阳性拆不出，这是否正常。对于COBASs201罗氏核酸检测结果，反应性结果优先于其他结果，反应性结果不能被拒绝，即便IC无效，反应性pool将报告为反应性，无效IC将会使无反应性靶标结果无效。针对该科2018年1—10月间罗氏核酸检测系统中无效原因见表1，从表1分析可以看出，导致实验检测无效的原因有很多，其中最为主要的是对照品的无效检测，对此：①要加强人员操作方面的培训，严格遵守正规操作流程，对照品温和倒置混匀3次（倒置需要等待2 s），并室温平衡30 min;不要长期开盖暴露在空气中。②做好对照品的抽检及确认，试剂是否存在批间差异，试剂与质控品是否匹配。
　　3.3  清洁消毒
　　 PCR实验强大的扩增能力和检测的敏感性致使极其微量的污染都会导致假阳性的出现，所以PCR实验过程中，防污染工作是一个不容忽视的问题，检测完成后要注意环境，设备的清洁与消毒，包括：①酒精对设备、台面、移液器、振荡器、离心机、冰箱外及把手、生物安全柜面、进行擦拭;②酒精对空喷洒，使其可能悬浮于空气中的核酸片段进行沉降，使其沉降于地面;③10% 84消毒液对地面、操作台面进行擦拭;④10 min后地面用清水处理一遍、台面用清水处理两遍;⑤紫外灯车对操作台面进行照射离开实验室;⑥屋顶紫外灯按照设定好的时间自动进行照射（22：00-24：00）;⑦废弃物处理，包括一般包装（试剂耗材包装）、污染类（承载标本的管类、参与标本混合的试剂、扩增产物）清洁消毒。
　　 血液核酸检测技术具有高度的敏感性，可大大缩短血液检测窗口期，在提高血液安全性方面，降低输血传染病感染的风险有重大意义。该文就罗氏核酸检测系统关键控制点做了初步讨论，仍然需要不断探索分析，只有完善质量控制，健全质量体系，才能保证核酸检测工作准确、可控的开展。
　　[参考文献]
　　[1]  郭丹，王安琪，孙健，等.浅谈生物样本的质量保证与质量控制[J].中华临床实验室管理电子杂志，2017，5（1）：36-45.
　　[2]  何成涛，马贵明，赵静.血站核酸检测工作的质量控制[J].临床血液学杂志：输血与检验，2015（6）：1074-1076.
　　[3]  赵宇，王艳.科华核酸血液筛查系统的质量控制[J].中国卫生产业，2017，14（3）：49-51.
　　[4]  朱守兵，刘祎，章雪江，等.血液核酸筛查中的质量控制探讨[J].浙江实用医学，2015，20（5）：366-368.
　　[5]  吴亚玲，祝宏，董杰，等.血液核酸筛查室内质控品浓度选择的探讨[J].中国输血杂志，2013，26（2）：170-171.
　　[6]  张妍，唐建华，李英莲，等.核酸检测实验室常用质量监控指标的探讨[J].中国输血杂志，2014，27（6）：620-622.
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