蓝莓试管苗生根技术研究进展

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　　摘  要：蓝莓是21世纪极具有发展潜力的一个新兴树种，组织培养是实现蓝莓大规模生产的有效途径。但由于其根系纤维不发达、生根困难，导致组织培养过程中繁殖系数低。该文综述了蓝莓试管苗生根技术的研究进展，阐述了诱导组培苗生根的机理与方法，分析了影响试管苗生根的主要因素，为组织培养技术用于蓝莓研究和种苗生产提供参考。
　　关键词：蓝莓;离体;组织培养;生根
　　中图分类号 S663.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0025-04
　　Abstract： Semen trigonellae is a new tree species with great potential in this century.Tissue culture is an effective way to realize large-scale Production of it.The root fiber of blueberry is underdeveloped and difficult to take root，  which results in low reproductive coefficient in tissue culture.In this paper，  the research progress of rooting technology of blueberry tissue culture seedlings was reviewed，  the mechanism and method of rooting induction of tissue culture seedlings are described，  the main factors affecting rooting of test-tube seedlings were analyzed.This paper is write to provide reference for the development of Semen Trigonellae study and industrialization.
　　Key words：Semen trigonellae; Tissue culture; Explant; Rooting
　　蓝莓，是中国对杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物中蓝果类型的俗称[1]，其果实中含有较多的花色素苷、黄酮等生理活性成分，具有多种营养保健功能和较高的经济价值[2]，是一种极具商业前景的小浆果类果树。中国蓝莓的概念范畴是包括目前国内主栽原产北美的高丛蓝莓、矮丛蓝莓、兔眼蓝莓和原产中国的笃斯越桔（橘），以及少量进口欧洲越橘（Bilberry）的果实和植株，与之相关的名称包括蓝莓、blueberry、越桔、越橘、蓝浆果、笃斯越桔（橘）[1]。蓝莓的传统繁殖方法主要有扦插和分株繁殖2种，存在繁殖效率低、规模小、出苗质量参差不齐等问题，难以满足市场的需求。而应用植物组织培养技术，具有繁殖周期短，繁殖系数高，能在短时间内繁殖出大量无菌、高品质的种苗的优点，现已成为蓝莓商业化育苗的新方向。
　　蓝莓在中国的研究起步较晚。1981年，吉林农业大学郝瑞教授从美国引种蓝莓。1990年，陈慧都等发表了越桔组培工厂化育苗研究成果，随后各地开始对蓝莓育苗技术进行研究。苗木繁育技术的发展，尤其是组培工厂化育苗技术的应用，加速了中国蓝莓产业的发展[1]，组织培养快速繁育已成为了蓝莓苗木繁育的主要途径[3]。目前，国内外已开展了许多蓝莓新品种或优选品系的组织培养繁殖技术的研究，积累了比较丰富的经验与数据，但有关蓝莓离体繁育瓶内生根的问题至今仍是一个急需攻克的难题。
　　本文综述了蓝莓试管苗生根技术研究进展，阐述诱导组培苗生根的方法，分析影响试管苗生根的主要因素，为组织培养技术用于蓝莓研究和种苗生产提供参考。
　　1 根发生、发育的形态解剖构造
　　根系发生于根原基，根原基通常分为2种，诱生根原基和潜伏根原基。诱生根原基是从外植体的维管形成层、韧皮薄壁组织细胞、韧皮射线等部位形成的，在扦插前并不存在;而潜伏根源基在外植体取材时便具有，但处于休眠状态，待接种后在环境适宜下发育成根[3]。通常由诱生根原基发育不定根的树种扦插生根较难。
　　由于根原基形成的时间、部位和机制的差异，不定根的形成可分为皮部生根型、愈伤组织生根型和中间生根型。不同植物的生根和不定根形成类型都不同：魏丽秀等在研究山苍子扦插生根解剖时发现，其生根类型为诱导生根型[4]。韩超等在研究桉树无性系组培生根发现，有皮部生根型，也有愈伤组织生根型[5]。
　　目前较少涉及蓝莓组培生根的解剖学观察。王雪娇对美登蓝莓组培苗生根解剖学研究时发现，美登组培苗的茎中没有潜伏根原基的存在，不定根是由诱生根原基发育而来的，并且诱生根原基起源于木质部细胞，经过不断的分化形成根原基，最终形成不定根[6]。王济红对兔眼蓝莓扦插过程中插条下剪口形态变化进行观察，结果表明，兔眼蓝莓的根系形成于愈伤组织，愈伤组织形成分为3个阶段，即愈伤组织诱导阶段、愈伤组织初产生阶段和愈伤组织大发生阶段[7]。
　　2 生根方法
　　组培苗的生根方法有试管内和试管外2种，都需要使用植物生长调节剂生长素类物质诱导。
　　试管内生根分为瓶内固体培养基生根、瓶内浅层液体培养基生根法。固体培养基生根包括：（1）持续诱导生根法：试管苗在含有生长素的固体培养基（生根诱导培养基）上持续培养，诱导不定根发生[8];（2）生长素—活性炭（生长素—AC）诱导生根法：试管苗先在含生长素的培养基上培养一段时间以诱导根原基的发生，再转移到含AC的培养基上持续培养以促进根原基生长;（3）生长素速蘸—AC诱导生根法：将试管苗基部浸入生长素溶液中一定时间，转接到含AC的固体培养基上持续培养。试管内根原基发生较容易，生根试管苗的根系无吸收功能或极低，移栽根系容易受到琼脂的污染，成本較高[9]。 　　试管外生根是将试管苗作为微型插穗直接扦插于无菌基质上使之生根形成小植株的方法。试管外生根的优点在于其把生根与驯化相结合，节约了育苗成本，同时瓶外生根苗避免根系更加健壮，且生出的根系有正常的输导组织[10]。但当试管苗从无菌状态的高温、高湿、弱光的环境移栽到有菌状态的自然条件，一些弱苗、小苗会因不适应环境条件的变化而死亡[11]。
　　这2种方法在蓝莓组培苗生根中都有应用。刘忠辉等采用蓝莓品种‘夏普蓝’继代芽苗为试材，实验比较了蓝莓组培苗3种方法（瓶外生根、固体培养基生根、瓶内浅层液体培养基生根）的生根效果，结果表明，瓶内浅层液体培养基生根效果较好[12]。潘忠强等探讨了固体培养基生根和瓶外生根对蓝莓品种‘巴尔德温’生根的影响，结果表明，表面瓶内生根处理的生根率更高，但瓶外生根的质量更好[13]。研究者尚未对最佳的生根方法达成一致的结论。不同生根方法所用的基质、植物生长调节剂种类、含量均不同。
　　3 生根影响因素分析
　　3.1 品种与基因型 蓝莓基因型差异对不定根的分化有着重要影响，不同品种材料在形态结构、生长发育规律及对外界环境条件的适应能力等方面都存在明显差别，试管苗生根的难易程度也有差别。乌凤章等研究了8个蓝莓品种生根情况，结果表明，不同蓝莓品种的插生根能力不同，其中公爵的生根能力最好，达到86.3%，而北陆生根能力最差仅28.3%[14]。朱世银等对安娜、莱克西、南大、奥尼尔等4个蓝莓品种的组培复壮瓶苗进行了试管外生根，结果表明，4个品种中，南大生根率最高达60%，奥尼尔第2为49%，莱克西第3、为44%，安娜最低只有27%[15]。张舵等以‘斯巴坦’及‘北陆’2个蓝莓品种试管苗为试材，结果表明，2个蓝莓品种在相同的条件下生根无明显差异[16]。随着现代分子生物学技术的发展，基因型差异与生根关系还有待进一步挖掘。
　　3.2 基本培养基 低无机盐浓度可以促进植物根系生长，因此大部分蓝莓生根培养基生根培养基采用1/2WPM添加不同浓度的生长素。甄成等对杂种蓝莓（野生ב美登’）在添加IBA的1/2WPM培养基进行生根诱导，结果表明，生根率高达88%，且生根周期仅为40d，移栽成活率达到85%以上[17]。梁文卫等以蓝莓品种美登的无根试管苗为试材，脱脂棉为支持物，添加1/2WPM及不同浓度的IBA、NAA和蔗糖为培养基，生根率为100%[18]。除了1/2WPM培养基，WPM培养基、1/2CQWL、改良1/3WPM培养基培养基也被用作生根的基本培养基。黄作喜以添加IBA的WPM为培养基时生根率为40%，在添加活性炭后生根率有所上升[19]。黄科等采用1/2CQWL培养基添加适量IBA诱导蓝莓’Sharpblue’生根，生根率达73%，单株生根4～5条[3]。阳翠等，研究了北高丛蓝莓‘莱格西’在改良WPM、改良1/2WPM、改良1/3WPM生根情况，结果表明，1/3改良WPM生根效果最佳[20]。但鉴于蓝莓种和品种丰富，对不同品种和外植体有必要系统、综合地分析培养基成分对试管苗生根的影响，以获得最佳基本配方。
　　3.3 激素处理 无论试管内还是试管外生根，适量使用生长素类物质都可以诱导根原基的发生，并促进不定根的生长。常用的生长素类物质主要有IBA、NAA、IAA等，其中IBA使用最多[21]。不同生根方法所用的植物生长调节剂种类、用量均不同，在这里需要进行分开讨论。
　　3.3.1 试管内生根 在IBA持续诱导生根法中，IBA的添加浓度一般在0.05～5mg·L-1，使用浓度因蓝莓品种及培养基中其他因素而异。李森等研究认为高丛蓝莓生根的适宜浓度为IBA0.1mg·L-1[22]。吴光洪等以兔眼蓝莓优良品种‘粉蓝’壮苗后进行瓶内生根，添加0.8mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.1g·L-1活性炭（AC）生根效果最好[23]。梁文卫等发现蓝莓品种‘美登’在添加2.0mg·L-1IBA、0.2mg·L-1NAA和20g·L-1蔗糖的培养基生根率达100.0%，20d后即可达到移栽要求[18]。郑理乔等将蓝莓继代培养试管苗转入添加0.2mg·L-1IBA，并含100～200mg·L-1活性炭的培養基时生根情况最为理想[24]。朱芳明等研究表明，“兔眼蓝莓”的最佳生根激素浓度为IBA2.0mg·L-1，生根率达92.10%，生根数多，根长势好[25]。王大平等研究表明，兔眼蓝莓试管苗添加IBA0.5mg·L-1和活性炭0.3%的培养基上，平均生根率达78.7%[26]。孙书伟等以蓝莓品种‘蓝丰’、‘伯克利’组培苗为材料，结果表明，蓝丰在IBA0.1mg·L-1生根效果更好，伯克利在IBA0.05mg·L-1的培养基上更好[27]。
　　生长素速蘸—AC诱导生根法，用来速蘸的IBA溶液的浓度一般在100～500mg·L-1，蘸取时间在2～10s。韩德伟研究了外源激素IBA对蓝莓组培苗瓶内生根的影响发现，将蓝莓苗浸蘸200mg·L-1IBA中5s后再接种到基本培养基中，生根速度加快，发根周期变短且生根率明显提高[28]。阳翠等用300mg·L-1的IBA浸蘸5s后，接种于生根培养基中，10d后蓝莓组培苗就开始长根，且生根率也有所提高[20]。
　　3.3.2 试管外生根 试管外生根方法与生长素速蘸–AC诱导生根法生长素的浓度接近。区别在于试管外生根法在速蘸后扦插到基质上，将移栽与生根同步进行。姚平等将经过复壮的组培苗剪成2cm左右的茎段，置于100mg·L-1IBA溶液中并立即捞出，于温室中扦插到以苔藓为基质苗床上，立即扣小拱棚保，40d生根成活率可达70%～80%[29]。王雪娇等以笃斯越橘优系SL-1的试管苗茎段为试材，研究不同浓度的IAA与IBA溶液浸蘸、浸蘸时间及浸蘸深度对其生根的影响，结果表明：笃斯越橘优系SL-1试管苗茎段浸蘸IBA比IAA生根效果好，且在300mg·L-1IBA中浸蘸10s时，生根率与生根条数最高，生根率达100.0%;试管苗生长健壮，生根快;试管苗茎段浸蘸不同深度时，以基部浸蘸生根效果最佳[30]。李京等将“美登”蓝莓组培苗蘸取ABT1号500mg·L-130s情况下生根率达97.0%[31]。乌凤章提出北陆插穗经生根剂处理后，扦插生根质量明显高于对照，其中在1000×10-6的IBA中速蘸，扦插生根效果最好，生根率达到82.1%，其次是在50×10-6的IBA、150×10-6的NAA、50×10-6的ABT2号中浸泡2h，生根率可达70%以上[14]。 　　3.4 环境条件 试管苗生长的环境条件是指生长环境中的温度、光照强度、水分、气体交换、营养成分等。试管内生根时湿度达到饱和、营养成分充足，主要考虑温度、光照等。试管外生根则更容易到环境条件的影响。
　　3.4.1 试管内生根 暗处理与试管苗继代次数也是影响蓝莓生根的重要因素[21]。研究表明，将蓝莓试管苗先暗培养进行7d，再进行光照培养，可明显提高生根率;对于蓝莓试管苗继代次数而言，只有继代到5代后，才可进行生根培养，且随继次数增加，生根率不断提高[32]。赵勇刚等在改良1/2WPM培养基中加入0.6mg·L-1IBA和不同含量活性炭（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）诱导蓝莓组培苗生根，研究活性炭对蓝莓组培苗生根的影响，结果表明，当培养基中含活性炭0.10%～0.20%时，培养30d左右有根发生，培养50d后生根率比对照（不加活性炭）增加66.0%～91.8%;培养基中加入0.10%活性炭可抑制组培苗落叶，促进组培苗健壮生长[33]。
　　3.4.2 试管外生根 在组培苗试管外生根的过程中，温度和湿度是是至关重要的影响因素。气温可满足芽的活动和叶片的光合作用，地温则影响生根速度，一般来说土温略高于气温有利于生根[34]。湿度对植物扦插生根也有重要的影响，刚扦插时组培苗没有根系，这个阶段的空气湿度是维持组培苗存活的关键。研究发现，温度保持在20～25℃，扦插生根效果较好[35]。以笃斯越橘优系SL-1组培苗为试材，探讨环境条件的影响，结果表明，组培苗瓶外生根的最佳环境条件为22～25℃，湿度80%[36]。美登蓝莓组培苗适宜的培养温湿度条件为温度25℃、湿度75%[37]。前7d应保持小拱棚内空气相对湿度在95%以上，之后14d保持相对湿度在85%～90%，温度保持在20～28℃，20d后逐渐揭开保湿的塑料膜。为了保持插穗的水分，可以采用自动间歇喷雾装置，以提供充足的水分。此外，还可以利用遮阳网来维持空气湿度[29]。
　　光照对组培苗试管外生根也有一定的影响，其主要是通过对插穗自身代谢的控制来实现的。光照刺激芽的生长，抑制根的发育，因此，在诱导试管苗生根时应适当遮阴，刺激插条先生根，后抽梢发叶，提高试管苗的成活率。在扦插时，要选择合适的光照强度，从而利于生根[39]。一般30%～50%的透光量较为适宜，且50%左右的透光率最佳。强光照射会使插穗过度失水而枯萎，而过度的遮阴又会导致叶片黄化脱落。另外，适度的光照可以使嫩枝的叶片进行少量的光合，从而为生根提供能量[6]。每天光照时间8～10h，4—5月栽植瓶外生根数量多[36]。
　　在扦插过程中，基质起着重要的作用，它可以支持和固定植物，为植物提供相对适宜的生长环境。不同基质的保湿性、透气性和抗菌性等能力都不相同，因此在选择基质时，要根据植物本身的特点进行选择。以“园蓝”品种为试材，进行了架空苗床和地表苗床瓶外生根效果的比较分析，并对瓶外扦插生根基质进行筛选，得出混合基质椰糠和水苔（体积比6∶4）生根效果好，生根率达96%以上，生根苗移栽的最佳基质是草炭土∶苔藓为2∶1[36]。有研究者以美登蓝莓为试材，研究了不同基质对"美登"蓝莓组培苗室外移栽的影响，结果表明，移栽基质以沙子+草炭土（1∶1）最佳[37]。
　　4 展望
　　蓝莓因其丰富的营养保健价值与广阔市场前景，在世界各地广泛种植。中国蓝莓研究虽然起步较晚，但是发展迅速，蓝莓的组织培养技术也不断成熟。目前，蓝莓的试管苗生根研究取得了一定的成果，影响生根的因素主要有外植体、培养基成分、激素处理、生根环境（温度、湿度、光照等），部分品种的试管苗已经能够实现了生根移栽成活。
　　今后应加强生根机理方面的研究，从解剖学、生理生化、分子生物学等方面进一步探寻不定根发生的机理，探寻生根过程中、内源激素、相关酶活性的变化规律，分析生根过程中的基因表达等，这些在其他木本植物上已经有所涉及。生长素反应因子（ARFs）是植物界特有的转录因子蛋白，它们与生长素早期反应基因（Aux/IAA基因，SAUR基因和GH3基因）启动子内的生长素顺式作用元件TGTCTC（AuxREs）特异性结合来调节这一类基因的表达;宋晓波等确定核桃不定根发生过程中高效、稳定表达的内参基因，研究不定根发生相关基因的表达模式[38]。相信随着研究的不断深入，与蓝莓发根有关的基因将会被进一步挖掘和利用，从根本上解决蓝莓生根问题，促进蓝莓组织培养技术的推广应用。
　　参考文献
　　[1]吴林，中国蓝莓35年——科学研究与产业发展[J].吉林农业大学学报，2016，38（01）：1-11.
　　[2]林维耀，张伟强，张立杰，等.蓝莓果实营养保健与贮藏保鲜研究综述[J].东南园艺，2018，6（01）：49-54.
　　[3]黃科，黄琴，代欢，等.蓝莓离体快繁及生根特点研究[J].经济林研究，2016，34（01）：140-146.
　　[4]魏丽秀，李培旺，彭映辉，等.山苍子嫩枝扦插生根过程的形态解剖学研究[J].林业科技通讯，2018（04）：17-20
　　[5]韩超，徐晓立.3种桉树组培苗不定根发生发育过程的解剖学观察[J].西北植物学报，2016，36（08）：1594-1599.
　　[6]王雪娇.蓝莓组培苗扦插繁殖技术与生根机理的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2016.
　　[7]王济红.兔眼蓝莓扦插繁殖生根机理研究[D].贵阳：贵州大学，2007.
　　[8]Harris R A，Mantell S H.Effect of stage subculture duration on the multiplication rate and rooting cap Ⅱ acity of micropropagated shoots of tree peony[J].Hort Sci.，1991，66（1）：95-102. 　　[9]张倩，王华芳.牡丹试管苗生根与移栽技术研究进展[J].园艺学报，2012，39（09）：1819-1828.
　　[10]郭素娟.林木扦插生根的解剖学及生理学研究进展[J].北京林业大学学报，1997（04）：66-71.
　　[11]徐振华，王学勇，李敬川，等.试管苗瓶外生根的研究进展[J].中国农学通报，2002（04）：84-86，89.
　　[12]刘忠辉，谢善松，黄水珍，等.蓝莓组培苗三种生根方法效果比较[J].南方农业，2016，10（13）：48-49，78.
　　[13]潘忠强，李海宁，焦功强.不同处理对蓝莓（Blueberry）试管苗瓶外生根影响[J].河南农业，2016（11）：15.
　　[14]乌凤章，王贺新，陈英敏.蓝莓嫩枝扦插繁殖技术[J].东北林业大学学报，2007（11）：44-46.
　　[15]朱世银，武孔敏，蔡荣靖，等.不同蓝莓组培苗在不同基质中的瓶外生根技术初探[J].南方农业，2016，10（15）：61-62.
　　[16]张舵，杨艳敏，魏永祥，等.激素配比和pH值对蓝莓试管苗增殖生长的影响[J].北方果树，2015（03）：13-14.
　　[17]甄成，毕显禹，李淑娟，等.杂种蓝莓（野生ב美登’）组培快繁[J].东北林业大学学报，2016，44（05）：29-33.
　　[18]梁文卫，宋鹏慧，阎聪，等.美登蓝莓试管苗瓶内快速生根试验[J].中国果树，2015（04）：44-47.
　　[19]黄作喜，胡东方，李强，等.蓝莓生根培养基的筛选[J].内江师范学院学报，2016，31（12）：37-41.
　　[20]阳翠，王军，董顺文，等.培养基组分对蓝莓组培苗瓶内生根的影响[J].植物生理学报，2016，52（09）：1438-1442.
　　[21]宋刚，徐银，宋金耀，等.蓝莓试管苗不定根的诱导研究[J].江苏农业科学，2011，39（06）：89-91.
　　[22]李森，高麗霞，刘念，等.高丛越橘“奥尼尔”的组织培养[J].北方园艺，2016（09）：102-105.
　　[23]吴光洪，孙英坤，陈林敬，等.兔眼蓝莓‘粉蓝’叶片直接诱导丛生芽再生技术体系的建立[J].植物生理学报，2016，52（03）：372-380.
　　[24]郑理乔，黄成林，刘华，等.兔眼蓝莓组织培养过程中褐化与生根问题的探讨[J].安徽农业大学学报，2012，39（05）：777-782.
　　[25]朱芳明，张太奎，刘惠民，等.兔眼蓝莓快繁技术研究[J].西南林业大学学报，2016，36（03）：73-79.
　　[26]王大平.兔眼蓝莓试管苗生根培养的研究[J].北方园艺，2010（16）：140-142.
　　[27]孙书伟.蓝莓组培苗瓶内生根的探讨[J].湖北农业科学，2009，48（04）：786-788.
　　[28]韩德伟.IBA对蓝莓组培苗瓶内生根的影响[J].江苏农业科学，2013，41（07）：38-40.
　　[29]姚平，孙书伟.蓝莓组织培养瓶内复壮瓶外生根快繁技术[J].北方园艺，2009（04）：161-162.
　　[30]王雪娇，代志国，高庆玉，等.蓝莓组培苗瓶外扦插生根的研究[J].江苏农业科学，2017，45（04）：30-32.
　　[31]李京，张妍妍，张建瑛.蓝莓组培苗瓶外生根技术的优化[J].林业科技，2013，38（05）：4-6.
　　[32]王平红.活性炭对蓝莓组培苗生根的影响[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11762-11763.
　　[33]赵勇刚，高克姝.论林木的无性繁殖及其应用[J].山西林业科技，1996（03）：14-17.
　　[34]彭醒醒，代志国，董畅，等.笃斯越橘组培苗瓶外生根和移栽条件研究[J].中国果树，2015（02）：35-37.
　　[35]李京，张建瑛，张妍妍，等.“美登”蓝莓组培苗移栽技术研究[J].北方园艺，2013（13）：36-38.
　　[36]宋晓波，常英英，刘昊，等.核桃qRT-PCR内参基因的筛选与不定根发生相关基因表达分析[J/OL].园艺学报：1-12[2019-03-24].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1924.s.20190218.1003.004.html.
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