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多糖含量测定的方法综述

作者:未知

  摘 要:多糖是生命科学中不可缺少的生物大分子,具有复杂、多方面的生物活性和功能,但由于其分子量大、结构复杂,而且缺少易于检测的发光基团,成为困扰人们对多糖进行进一步研究的一个大问题。现结合近年文献,对多糖的含量测定进行综述。
  关键词:多糖;含量测定;综述
  Abstract:Polysaccharides are indispensable biological macromolecules in life science, which have complex and multifaceted biological activities and functions. It has been a problem with the research of polysaccharides because of its intricate structur. In conjunction with recent literature, a review of polysaccharides has been determined.
  Key words:Polysaccharides; Content determination; Review
  中图分类号:Q53
  多糖(polysacharides,PS)是由糖苷键结合的糖链,至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物,可用通式(C6H10O5)n表示。多糖在自然界分布极广,亦很重要:有的是构成动植物细胞壁的组成成分,如肽聚糖和纤维素;有的是作为动植物储藏的养分,如糖原和淀粉;有的具有特殊的生物活性,如人体中的肝素有抗凝血作用,肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。多糖的结构单位是单糖,多糖相对分子质量从几万到几千万。多糖在自然界高等植物、藻类、微生物(细菌和真菌)与动物体内均普遍存在。
  近年来,多糖的应用更加广泛。多糖因有着多种多样的生物学功能,成为了近年来的一大研究热点。多糖类物质具有复杂多样的生物活性和功能:多糖具有免疫调节功能[1],它能减少通常使用的免疫抑制剂的诸如细胞毒性、机体抗感染能力下降;还可以降低致病菌的繁殖速度[2-3];有些可以治疗慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病,甚至有着抗AIDS病毒的功能[4],有着抗感染、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成、抗放射、抗凝血的作用[5],能控制細胞分裂和分化,调节细胞的生长与衰老[6]等。
  多糖类物质的生物活性对人类的生命健康来说都具有极其高的价值。随着生活水平的提高和人口老龄化时代的到来,人类将更加关注保健与养生,而多糖类的广泛性与显著的生物学活性,正好契合这种需要。而且研究发现,多糖对人体无毒副作用,这一点特别受到世界医学科学研究者的厚爱,被誉为21世纪的人类医学保健领域的救星。因而多糖的研究已经成为了一大热点,多糖多样的生物活性与其复杂的结构息息相关,但是目前在多糖的结构和含量分析这一领域的研究还相对缓慢,多糖的结构复杂,因此在对其进行检测时就需要选用合适的方法。本文介绍了多糖含量测定的几种常用方法,各种方法都其优缺点,因此在选择时还需要根据实际情况具体分析应用。
  1 比色法
  1.1 硫酸-咔唑比色法
  硫酸-咔唑比色法是一种常见的被广泛应用于糖醛酸测定的方法,其原理是多糖经水解生成半乳糖醛酸,在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应,生成紫红色化合物,其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比,可比色定量。如郭欣等人[7]在研究中对酸性多糖中的葡萄糖醛酸(GA)与中性糖的含量进行测定。果胶(Pectin)是一组聚半乳糖醛酸,其主要成分是部分甲酯化的α-1,4-D-聚半乳糖醛酸,因此可用硫酸咔唑法测定果胶多糖的含量。此法简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅制作一条标准曲线,颜色持久。如陶阿丽等[8]在实验中使用咔唑硫酸比色法测定皖南山区豆腐柴叶中果胶的含量。本法操作简单、稳定性好,用于实际样品测定时效果较为满意。
  1.2 苯酚硫酸比色法
  苯酚浓硫酸法是一种简单快速测定多糖含量的方法,在各类研究中被广泛应用。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,在约
  490 nm处测定光吸收值,进而对样品定量。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160 min以上。尤献民等[9]应用该法对不同产地老头草中的多糖含量进行了测定,牛丽丽[10]在研究分析中测定了中国市场上淫羊藿中的多糖含量。
  1.3 蒽酮-硫酸法比色法
  蒽酮比色法是一种快速而简便的定量方法。蒽酮可以与游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620 nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。在应用此法进行分析时,注意蒽酮要避光保存。配制好的蒽酮试剂也应注意避光,当天配制好的当天使用。而且注意温度要控制在100 ℃,从100 ℃开始准确计时10 min,然后迅速冷却,于室温中平衡10 min,加热、比色时间应严格掌握。马昌豪
  等[11]采用硫酸-蒽酮比色法测定玫瑰花可溶性多糖和粗多糖的含量,对不同品种玫瑰花进行多糖含量的差异的研究。该方法操作简单,显色也非常灵敏。崔宏春[12]用蒽酮比色法测定绿茶水溶性多糖的含量。由此可见,该法在研究中被广泛应用。
  1.4 间羟基联苯比色法
  间羟基联苯比色法可对糖醛酸进行测定。多聚己糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下水解,水解产物进一步与间羟基联苯反应,生成粉红色衍生物,产生紫外吸收,且在一定浓度范围内,该衍生物吸收值与糖醛酸含量呈线性关系,可通过比色法对糖醛酸含量进行计算。间羟基联苯法是糖醛酸含量测定中比较成熟的方法。间羟基联苯法操作简便灵敏,样品稳定性、重现性较好,回收率高。俞丹等[13]人用该方法对多糖中糖醛酸含量进行测定。   1.5 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法
  利用碱性条件下,二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应,生成3-氨基-5-硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下显棕红色,且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理,用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关,而对还原糖的种类没有选择性,故DNS方法适合用在多糖(如纤维素、半纤维素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。张向萍等[14]采用该法对玉竹滴丸中单糖进行含量测定。经DNS试剂显色后,于540 nm处测定吸光度,在此波长处溶液的吸光度与葡萄糖含量呈良好的线性关系。该方法简单易行,重复性好,可作为玉竹滴丸质量控制标准。朱志川等[15]对党参均一多糖CPS-a的含量测定中采用此法测定多糖CPS-a含量,该法简便、快速,测定结果准确可靠。
  2 色谱法
  2.1 气相色谱法(GC)
  将多糖酸水解或甲醇醇解,用衍生物法以增加其挥发性,采用气相色谱分析法可测定其含量。刘源才等[16]用气相色谱法分析了枸杞多糖的含量,将枸杞多糖进行水解衍生化处理后用气相色谱法和高效液相色谱法测定单糖组成及多糖含量。Zenaida Guadalupe[17]文中介绍用气相色谱-质谱的方法,确定单个葡萄酒多糖的精细化学结构,而且可以估计葡萄酒中多糖的总体组成。可见该法操作简单、结果准确,因而被广泛应用。
  2.2 液相色谱法(HPLC)
  高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法,近年来也被广泛用于多糖的测定方面,可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。如王刚等[18]对山药多糖的提取分离及山药总多糖的含量测定研究中,利用HPLC法测定山药总多糖,结果较准确。薛俊
  杰[19]应用HPLC法甘露醇与其他单糖或糖醇有效分离,方法学研究发现,该法重复性好、精密度高和重现性好,且加样回收率在95%~105%,适合于北虫草中甘露醇的测定。由于糖类不具有紫外吸收和荧光吸收,可以对其进行衍生化处理,提高检测灵敏度。如Wenjing Zhang[20]研究中建立了一种快速、灵敏、重现性好、柱后荧光衍生化的高效液相色谱法测定体内低分子量硫酸多糖的含量,王佩香[21]采用该法进行了桑枝多糖的初步研究。由此可见,高效液相色谱法在多糖方面的研究应用十分广泛。
  3 红外光谱定量分析多糖法
  红外光谱定量分析是借助于对比吸收峰强度来进行的,只要混合物中的各组分能有一个特征的,不受其他组分干扰的吸收峰存在即可。原则上,液体、圆体和气体样品都能应用红外光谱法作定量分析。红外定量分析的原理和可见紫外光谱的定量分析一样,也是基于比耳-朗勃特(Beer-Lambert)定律。红外光谱定量方法主要有测定谱带强度和测量谱带面积两种。此外也有采用谱带的一阶导数和二阶导数的计算方法,这种方法能准确地测量重叠的谱带,甚至包括强峰斜坡上的肩峰。该法具有快速、简单,可以对多糖进行快速分析的优点。任绍刚[22]对云芝的含量测定研究了采用偏最小二乘法(PLS)建立云芝菌丝体干粉样品的近红外漫反射光谱与其中多糖和蛋白含量间相关模型。分别采用Savitzky-Golay平滑法、快速傅立叶变换(FFT)、一阶导数光谱法和二阶导数光谱法对所有样品的近红外漫反射光谱进行预处理,应用预处理后的光谱在不同的光谱区域分别建立定量分析模型。该分析结果表明该方法结果准确可靠,重现性、稳定性均良好,有望应用于大批量产品的快速、在线检测。
  4 紫外分光光度法
  紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200~760 nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法,操作简单、准确度高、重现性好。李孝栋等[23]采用紫外分光光度法测定黄芪中多糖的含量,通过对多糖部位的水溶部分、水不溶部分及两部分混合物的多糖含量测定,表明水溶部分与水不溶部分总多糖的含量和两部分混合物的多糖含量近乎相同。其主要特点为灵敏度高,可达
  10-4~10-7 g·mL-1;准确度高,相对误差为2%~5%。中药中有紫外吸收的成分或本身有颜色的成分,在一定的浓度范围内,其溶液的吸收度与浓度符合朗伯-比
  尔定律,均可用此法进行分析。卫强等[24]研究提取菊叶中多糖的工艺,并建立菊叶中多糖的含量测定方法。以紫外可见分光光度法检测多糖含量,该法测定方法稳定、操作简单,灵敏度和准确度高。如张由芹等[25]在对发酵天龍粉多糖的含量测定采时用紫外分光光度法,操作过程简单,准确度高,误差小。
  5 一些新的研究方法
  5.1 共振光散射(RLS)法
  成芳[26]在研究南方红豆杉含量中探究了一种新的对多糖含量进行测定的方法——共振光散射(RLS)法。研究表明:波长460.0 nm,NaOH浓度1.0 mol·L-1,CPC浓度1.0 mmol·L-1,与多糖反应10 min,RLS强度最大。在2.4~12 μg·mL-1范围内,RLS强度与多糖对照品浓度成线性关系。
  5.2 生物传感器法
  生物传感器(Biosensor)是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器,是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。利用酶的专一性反应,能实现多糖的测定和含量分析。作为多糖测定的一种较新的研究方法,该法近年来也成为关注的焦点。
  此外,氧化还原滴定法也可用于多糖的含量测定。但是水样中的还原性物质对糖的测定会造成影响,过程较为复杂,误差大。
  6 结语
  以上介绍了多糖含量测定的一些方法,不同的方法测定的特定多糖也不相同。因此在选择多糖分析方法时,要通过分析对比,以选择最方便简单的方法进行研究。   在多糖的测定中,比色法一般应用较为广泛。最为常见的有苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法,具有灵敏度高,结果较为准确的优点。但这两种方法也有一定的缺点,如实验操作较复杂,步骤多且繁琐,而且只可以测定多糖总体的含量,而不能测得含有单糖的部分物质,如果含有单糖,实验结果会有极大的误差。蒽酮-硫酸法比色法操作虽然简单,但是蒽酮试剂需要现用现配,而且需要严格控制实验操作的温度。而且在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加测定误差。二硝基水杨酸法操作简便、快速、灵敏度高,在多糖含量的测定中常被应用。光谱法具有操作简单,准确度和灵敏度都相对比较高的优点,因此可以在研究中广泛应用。
  另外,除了一些常见的对多糖含量进行分析的方法,还研究出了很多新方法用于多糖的含量测定,在测定时也同样被广泛应用。多糖因为其分子质量大,结构较为复杂,所以目前对多糖的研究进展还很缓慢。我国的多糖资源十分丰富,具有很大的研究和开发前景,而且多糖类药物在治疗肿瘤、抗病毒、降血糖等方面的贡献也越来越大,已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。同时也应看到,无论是国内还是国外,多糖的研究与蛋白质和核酸的研究相比还有相当的差距。所以开展各种植物多糖分离纯化及含量测定方法研究,既有理论意义,也有现实意义。此外,多糖分析还有其他一些方法,随着检测仪器不断革新升级,多糖含量检测方法趋于多样化。多糖含量检测总的发展趋势是使检测过程更简便、快速、准确、实现痕量检测、在线检测及更多反映结构信息等。
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