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清蒸大黄的炮制及其五种游离蒽醌的含量测定分析

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  摘要:采用HPLC法测定清蒸大黄中的5种游离蒽醌的含量。色谱柱为Thermo BDS HYPERSII C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-0.1%磷酸(76∶24)水溶液为流动相,检测波长为254 nm,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL。结果表明,芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别在0.020 7~0.414 0 μg(R2=0.999 9)、0.172 1~3.442 0 μg(R2=0.999 6)、0.020 3~0.406 0 μg(R2=0.999 9)、0.148 0~2.960 0 μg(R2=0.999 8)、0.164 0~3.280 0 μg(R2=0.999 3)的线性范围内呈良好线性关系,说明该方法可作为大黄及其不同炮制品的质量控制方法。
  关键词:清蒸大黄;游离蒽醌;炮制;高效液相色谱法
  中图分类号:O657.7+2         文献标识码:A
  文章编号:0439-8114(2019)07-0111-04
  大黄属中药泻下药,始载于《神农本草经》,历代本草均有收载。大黄为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill.)的干燥根和根茎[1]。掌叶大黄和唐古特大黄被称为北大黄,主产于青海和甘肃等地;药用大黄称为南大黄,主产于四川、陕西等地[2]。中国有大黄45个品种和2个亚种,但2015版《中国药典》只收录3种大黄,即正品大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎,主要有效成分有芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、没食子酸、番泻苷类、鞣质、大黄多糖和微量元素等[3,4]。大黄性苦、寒,归脾、胃、大肠、心、肝经,药理作用广泛,如泻下、消炎、抗菌、抗病毒、利胆、止血、降血脂、降血压等[5,6]。
  除了使用生品外,也常使用炮制品,根据医院临床用药的需要,大黄需炮制成不同炮制品。大黄含有多种有效成分,在加热蒸炒炮制过程中,其所含有效成分含量变化很大,药理药效随之发生变化。根据辨证施治的需要,合理选用不同的炮制品,才能提高中医用药的疗效,避免产生毒副作用[7-10]。试验采用HPLC法同时测定清蒸大黄中5种游离蒽醌成分,为综合评价清蒸大黄的药材质量提供方法。
  1  材料与方法
  1.1  仪器
  Waters 2695高效液相色谱仪,包括2489UV、四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3液相工作站;PRACTUM224-KNSOP电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];HWS-26电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)。
  1.2  试剂
  甲醇,色谱纯(美国Fisher科学世界公司);甲醇、乙醇,分析纯(国药集团化学试剂有限公司);醋酸镁(国药集团化学试剂有限公司);磷酸(国药集团化学试剂有限公司);超纯水,其他试剂均为分析纯。芦荟大黄素(批号:160520)、大黄酸(批号:170219)、大黄素(批号:170224)、大黄酚(批号:160124)、大黄素甲醚(批号:160602),纯度>98%,均购于上海融禾医药科技有限公司。
  1.3  方法
  1.3.1  清蒸大黃  取洗净生大黄片放入蒸制容器内,置水锅上,加热蒸约4 h,表面显微黑棕色,取出[11,12],晒干或烘干(图1)。
  1.3.2  色谱条件  Thermo BDS HYPERSIIC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.1%磷酸(76∶24),检测波长254 nm,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL。
  1.3.3  对照品溶液制备  分别精密称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚12.94、 12.69、14.34、12.33、13.67 mg,加入甲醇溶解,芦荟大黄素和大黄素分别定容至25 mL容量瓶中,大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚分别定容至10 mL容量瓶中,即得各对照品储备液。
  分别精密量取芦荟大黄素和大黄素对照品储备液1 mL,大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品储备液3 mL,置于25 mL容量瓶中,加甲醇稀释定容至刻度,即得混合对照品溶液,即芦荟大黄素20.70 μg/mL,大黄酸172.08 μg/mL,大黄素20.30 μg/mL,大黄酚147.96 μg/mL,大黄素甲醚164.04 μg/mL。
  1.3.4  供试品制备  取清蒸大黄粉末约0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加人甲醇25 mL,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
  2  结果与分析
  2.1  色谱条件
  按照“1.3.2”色谱条件,各组分分离度良好(图2)。
  2.2  线性关系考察
  分别精密吸取大黄混合对照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,分别以峰面积和进样量(μg)为纵坐标和横坐标,绘制标准曲线并计算回归方程。精密吸取上述大黄混合对照品稀释液进样,测定其信号(以峰高计算)与噪声比值,将S/N=3时的浓度定为检测限(LOD),将S/N=10时的浓度定为定量限(LOQ)。各组分在各自的含量范围内线性关系良好(表1)。   2.3  方法学考察
  2.3.1  精密度试验  精密量取混合对照品溶液适量,按“1.3.2”条件连续进样6次,分别记录各自的峰面积,并计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD。结果测得混合对照品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%,RSD都小于3.0%,表明所用液相色谱仪的精密度较好。
  2.3.2  稳定性试验  取清蒸大黄粉末0.5 g,按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液,分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h,按“1.3.2”条件依次测定各供试品的峰面积,结果测得清蒸大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.36%、0.39%、0.46%、0.25%、0.24%,其RSD值均小于3.0%,说明24 h内供试品溶液稳定性良好。
  2.3.3  重复性试验  精密称取清蒸大黄药材粉末6份,各0.5 g,按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液,按“1.3.2”条件依次测定各供试品的峰面积,计算大黄不同炮制品中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚平均含量,结果测得其含量分别为0.941 2、2.230 7、1.512 0、3.206 7、4.063 4 mg,其RSD值均小于3.0%,表明该方法重复性良好。
  2.3.4  加样回收率试验  精密称取清蒸大黄药材粉末9份,各0.25 g,分成3组,即低、中、高加样组,每组分别加入混合对照品溶液(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚),按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液,按“1.3.2”条件测定,计算清蒸大黄低、中、高加样组中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率及其RSD值,结果见表2。由表2可知,该方法准确性良好。
  2.4  样品含量测定
  称取清蒸大黄药材粉末(过2号筛)0.5 g,3份,按“1.3.4”方法制备成供试品溶液,按“1.3.2”条件测定,采用外标一点法计算大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量,结果见表3。
  3  讨论
  3.1  流动相的选择
  试验采用HPLC测定大黄游离蒽醌类成分,对其流动相进行了考察,发现流动相中加入不同种类的酸对5种游离蒽醌的分离有较大影响。本试验采用甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液和甲醇-0.1%冰醋酸溶液等流动相进行比较,结果表明,甲醇-0.1%磷酸溶液(76∶24)作为流动相,5种游离蒽醌分离效果较好,与杂峰达到基线分离。
  3.2  炮制品与其对应的药理相关性分析
  在蒸制的过程中,蒸气加热,温度高,破坏了主要泻下成分的结合型大黄酸,使其泻下作用下降;  而大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的增加,抑制血小板凝集作用,降低血小板活性,凝集状态得到改善,渗透压趋于正常。因此,清蒸大黄相对于生大黄来说,活血祛瘀的功效更好。生大黄经炮制后,其药效发生了改变,治疗范围扩大[13-15]。同时,经过蒸制,清蒸大黄对胃肠道刺激较生大黄有所下降。不同的中药炮制方法产生不同的炮制品,其治疗效果也会产生差异,所以临床上要辨证施治。
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