RAFT聚合法合成蛋白质分子印迹聚合物研究进展

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　　摘      要： 制备具有高选择性和亲和性的分子印迹聚合物（MIPs）是分子印迹技术发展的主要目标。以蛋白质等生物大分子为模板的分子印迹技术，面临蛋白质传質阻力大和蛋白质分子印迹聚合物形成的印迹位点不精确的问题。可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法作为活性可控自由基聚合的一种方法，单体选择范围广且反应条件温和。通过RAFT法制备得到的MIPs具有结构可控，形成位点均一等优点，有利于形成高质量的精确位点，增加选择性和亲和性。
　　关  键  词：分子印迹;蛋白质印迹;可逆-加成断裂链转移;后功能化
　　中图分类号：TQ 028; O658      文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）01-0077-04
　　Abstract： The preparation of molecularly imprinted polymers with high selectivity and affinity is the main objective in developing molecular imprinting technique. Molecular imprinting technique of proteins and other biomacromolecules is challenged by the difficulties in molecular diffusion and formation of high-quality imprints. As a kind of controlled radical polymerization， reversible-addition fragmentation chain transfer （RAFT） polymerization possesses properties of wide range of suitable monomers and mild reaction condition. The MIPs prepared by RAFT polymerization with controlled structures and homogeneity is beneficial to formation of high-quality accurate imprinting sites， which has advantages of improving selectivity and affinity.
　　Key words： Molecular imprinting; Protein imprinting; Reversible-addition fragmentation chain transfer （RAFT）; Post-functionalization
　　分子印迹技术是模拟抗原与抗体相互识别作用合成分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers，MIPs），形成与模板分子的“形貌”互补的空穴，通过记忆效应可对预定模板进行再吸附识别[1，2]。与昂贵且不易保存的天然抗体相比，MIPs具有成本低，制备过程简单，稳定性高，便于保存等特性[3]，虽然在有机溶剂中以小分子为模板的分子印迹技术取得了很大进展，但以蛋白质等生物大分子为模板制备蛋白质分子印迹聚合物面临诸多困难[4-6]：首先，蛋白质体积大，分子量高（大于10 KD），本身难以扩散，并且在交联印迹层中传质阻力大，模板难以洗脱和再吸附;其次，蛋白质结构复杂，构型易变，对温度、pH和溶液性质敏感，不溶于有机溶剂，但用水做溶剂却大大降低了模板与功能单体间作用力，不易形成高质量的精确印迹位点。
　　通过抗原决定簇法[7，8]、表面印迹法[2，9，10]及纳米尺度化[11]等方法可有效降低传质阻力，但如何提高MIPs的选择性和亲和性，制备具有高质量印迹位点的MIPs仍是一个难题。目前采用的方法主要是先将模板蛋白质通过共价作用或物理吸附至载体表面，因此其模板方向可控，合成印迹聚合物具有均一化的印迹位点。
　　制备蛋白质MIPs的方法主要有溶胶-凝胶法[12，13]，多巴胺自聚法[14，15]，自由基聚合法[16]等。其中，活性可控自由基聚合法制得的聚合物结构可控，有利于形成精确的印迹位点从而增强识别性能[17]。RAFT聚合法作为一种活性可控聚合的方法，通过加入二硫酯或三硫酯等链转移试剂，使聚合反应在活性增长自由基与休眠种（RAFT端基链）之间保持快速的动力学平衡，极大减少了自由基双基终止的可能，RAFT聚合可调控聚合物的分子量和结构，而且适用单体范围广，得到的分子量分布窄[18]。以上RAFT聚合法的特点为制备具有结构可控，位点均一，有精确性印迹位点的MIPs提供了新思路。目前采用RAFT聚合法制备蛋白质印迹聚合物主要有悬浮聚合，沉淀聚合和溶液聚合几种方法。
　　1  悬浮聚合
　　采用悬浮聚合法制备MIPs简单易行[19]，是指单体中溶解的交联剂和引发剂以油相小液滴的形式悬浮在水介质中，一个小液滴为本体聚合的一个单元，通过搅拌和分散性控制最终粒径大小，由此可制备得到微米级的聚合物。
　　Yang等[20]首次将RAFT聚合应用于蛋白质分子印迹领域，首先利用小分子RAFT试剂，（4-氰基戊二酸）-4-二硫代苯甲酸酯（CAD）合成含多糖的大分子RAFT试剂。以甲基丙烯酸甲酯（MMA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂，再加入新合成的大分子RAFT试剂为油相;然后加入含有模板牛血清蛋白（BSA）的去离子水中，在40 ℃条件下通过机械搅拌制备得到粒径为10～70 μm的BSA印迹微球粒子，将含糖聚合物链醇解为羟基后，亲水性增加。通过与传统自由基聚合得到的印迹粒子相比较，采用RAFT聚合制备的MIPs降低了非特异性吸附，并提高了选择性。 　　2  沉淀聚合
　　沉淀聚合是指随着聚合反应的进行，聚合物的聚合度不断增加，使其在有机溶剂中的溶解度逐渐降低，最终在溶剂中沉淀析出[21]。
　　Liu等[22]通过两步聚合的方法合成了具有核-殼结构的糖蛋白分子印迹纳米粒子。首先以甲基丙烯酸（MAA）为单体，N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）为交联剂，用蒸馏沉淀法制备得到亲水性纳米核，并且表面可残余大量双键;然后加入2-（十二烷基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（RAFT试剂），通过沉淀聚合在纳米粒子表面制备了一层聚丙烯酰胺基苯硼酸壳层，通过RAFT聚合可控制聚合速率，增加丙烯酰胺基苯硼酸在亲水核纳米粒子表面的接枝率，最终得到具有核-壳结构的纳米粒子。由于具有苯硼酸基团，因此该纳米粒子可对糖蛋白进行吸附。通过对糖蛋白辣根过氧化物酶（HRP）和非糖蛋白BSA吸附洗脱的测定结果表明，可对HRP进行特异性吸附，吸附量高，选择性好，并且动力学快。
　　3  溶液聚合
　　溶液聚合法与沉淀聚合不同，从始至终单体和生成的聚合物均可以稳定分散在溶剂中，是分子印迹领域中一种常用的方法，常用于在载体表面修饰蛋白质印迹聚合物层。
　　3.1  “接枝到”（grafting to）法
　　“接枝到”（grafting to）法指的是RAFT试剂先在溶液中引发聚合，生成的聚合物通过SiO2纳米粒子表面的羟基或者载体经过预先修饰的功能基团与聚合物链具有特定相互作用，实现聚合物接枝到载体表面。
　　我国学者张玉奎课题组[23]将抗原决定簇法与RAFT聚合法相结合，以转铁蛋白的抗原决定簇肽链为模板制备了可特异性识别转铁蛋白的印迹微球。首先将硅球用氨基硅烷修饰后，偶联戊二醛，然后在硅球表面共价接枝转铁蛋白的抗原决定基N端九肽链，固载模板后，在溶剂中加入功能单体、RAFT试剂和自由基引发剂引发聚合，洗脱模板肽链后得到了印迹微球。该微球对模板抗原决定基的印迹因子为1.89，对转铁蛋白的印迹因子为1.61;并且在转铁蛋白与细胞色素C的竞争吸附中对转铁蛋白的印迹因子远高于细胞色素C，具有优良的选择性。
　　Zhao等[24]通过一步聚合的方法制备得到可以在活体细胞中选择性吸附目标蛋白的荧光磁性纳米粒子。先将自由基引发剂固载至Fe3O4@SiO2纳米粒子表面，然后在缓冲液中加入荧光单体和其它辅助功能单体，PEG化的亲水性RAFT试剂，通过紫外引发，制备得到具有亲水性的脱氧核糖核酸酶I印迹纳米粒子。不仅可以用于活体细胞识别模板蛋白，而且可通过PEG的亲水性及抗蛋白吸附性降低非特异性吸附，提高选择性。
　　但由于该方法为溶液聚合，并不能保证后加入的RAFT试剂全部位于纳米粒子外表面，导致聚合物壳层内部具有一定量PEG，从而影响单体与目标蛋白的相互作用，不利于形成高亲和性印迹位点。除此之外，RAFT试剂被包埋也不利于对RAFT试剂端基再引发聚合或进行后功能化修饰。而grafting from法不具有这样的缺点。
　　3.2  “接枝于”（grafting from）法
　　采用RAFT聚合制备MIPs可先将RAFT试剂通过不同方法固载至载体表面，使反应在载体表面开始引发，聚合反应结束后RAFT试剂仍处于聚合物外表面，有利于通过对RAFT试剂胺解或还原等反应对MIPs进行后功能化修饰及应用[25]。
　　由于离子液体可影响蛋白质的水化环境，进而可以稳定蛋白质结构，因此在印迹蛋白质时可以加入离子液体为功能单体。Qian等[26]用两步聚合的方法以离子液体作为热稳定剂制备了溶菌酶印迹的微球。先用RAFT沉淀聚合的方法制备得到聚甲基丙烯酸微球，使得表面有一定量的RAFT试剂;然后用微球为载体，在缓冲溶液中以溶菌酶为模板蛋白，离子液体（chol dhp），丙烯酸羟乙酯（HEA）为功能单体，在75 ℃的条件下用过硫酸铵（APS）为热引发剂引发聚合，在其表面成功修饰聚合物层，最终制备得到可特异性识别溶菌酶的印迹微球。与不加离子液体合成的印迹微球相比，该印迹微球印迹效果好，选择性高。Gong等[27]采用与Qian等类似的方法制备可识别ADP-核糖化蛋白的印迹微球。同样先通过RAFT沉淀聚合制备表面含有RAFT试剂的微球粒子;其创新点在于腺苷是ADP-核糖化蛋白最外表面的组成部分，可以在第二步聚合时以腺苷为模板，合成的印迹微球可对ADP-核糖化蛋白特异性选择识别。该方法虽与抗原决定簇法类似，同样可以降低传质阻力，但该方法有效避免了抗原决定簇在溶剂中有一定链柔性，造成构象改变的不足。
　　Zhang课题组[28]以硅球（5 μm）为载体，先通过缩合反应在表面固载RAFT试剂。然后以修饰成功的微球粒子为载体，以溶菌酶（Lyz）为模板蛋白，在水相中用氧化还原引发剂在40 ℃引发聚合，洗脱模板后，得到具有核-壳结构的Lyz-MIPs微球。结果表明选择性好，吸附动力学快;但载体为微米球，比表面积不高，形成印迹位点数有限，因此特异性吸附容量低（5 mg/g），而且使用的RAFT试剂带有疏水性苯环，不利于在水体系中稳定分散，也是导致吸附量不高的原因。
　　以上“接枝于”（grafting from）法得到的MIPs均为微米粒子，其比表面较低，吸附容量小。若以纳米粒子为载体，通过提高比表面积可在很大程度上增加印迹位点数及吸附量。最近Boitard等[29]采用RAFT聚合在纳米材料表面接枝一层较薄的聚合物层，合成具有核-壳结构的印迹纳米材料。以磁性Fe3O4纳米粒子为载体，利用RAFT试剂的羧基基团与Fe3O4纳米粒子的铁离子形成配位作用使其固载至纳米粒子表面。然后通过BSA与丙烯酰胺（AAm）单体在水中预聚合形成氢键后，将上述功能化的纳米粒子分散在其中，加入交联剂MBA，最后引发聚合，合成了BSA印迹的磁性纳米粒子。通过不同聚合时间的各种表征数据表明RAFT聚合对壳层厚度及吸附性能具有可控性。在聚合时间为18 h时印迹效果最佳，对BSA的吸附量达到294 mg/g，并且通过测定与BSA相似性质的两种蛋白质吸附表明该纳米粒子对BSA具有特异吸附选择性。 　　4  结束语
　　通过RAFT法制备得到的MIPs结构可控，位点均质化，有利于解决印迹位点不精确的问题，从而提高选择性和亲和性。用RAFT聚合法制备核-壳结构的MIPs可降低传质阻力，在此基础上将其纳米尺度化增加印迹位点更有利于提高印迹效果。
　　虽然RAFT链转移剂固载至载体表面较困难，但在聚合反应结束后RAFT端基仍位于外表面，通过对RAFT试剂的氧化、还原、胺解或水解等反应，为MIPs后功能化修饰及固载至传感器表面进行蛋白质分子的识别与定量检测奠定了基础。
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