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质粒DNA提取方法的研究进展

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  摘 要:在生物实验中,质粒DNA常常作为基因载体运载工具使用,应用非常广泛,质粒DNA的提取通常在实验室内进行,保证其提取的效率和质量对生物实验研究具有重要意义,基于此本文对质粒DNA的提出方法进行了探讨。
  关键词:质粒DNA;提取方法;研究
  质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程领域,质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中,质粒DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。在质粒DNA的应用过程中,其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响,因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。
  在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步,培养细菌,使质粒扩增;第一步,进行细菌的收集和裂解;第三步,质粒DNA的分离和纯化。在质粒DNA的提取过程中,其提取效果和其大小呈现出正比例关系,越小越容易进行提取,这主要是由于,如果质粒DNA比较大的话,其特性机会和染色体DNA比较接近,这样想要将二者分离开来难度就会变大。在进行质粒DNA的分离时,适宜的条件是非常重要的,主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等,在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA才能够更好的分离开来。细菌浓度对于质粒DNA的提取也是非常重要的,如果细菌的浓度比较高,那么在溶菌时,溶菌液很难和细菌液充分混合,导致溶菌不彻底的问题,这样会造成质粒的回收率比较低;而如果细菌溶度比较低,溶菌液和菌液均分混合,会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片,在这样的情况下,沉淀时质粒回合这些物质共沉,进而导致质粒的回收率也会比较低。在生物学的相关研究之中,细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作,主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等,下面对这些方法的最新研究进行介绍。
  1 碱裂解法
  碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒DNA提取方法,这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高,操作便捷,缺点是需要较长的提纯时间。研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究,但是没有得到理想的效果,当前这一方法提取DNA的时间都在1.5h以上。碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选,在菌液中加入溶液Ⅰ,使细菌细胞悬浮,同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+螯合,起到抑制DNase活性的作用;然后,加入溶液Ⅱ,将细胞裂解,在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质;再次,加入溶液Ⅲ,使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀,并使得质粒DNA复性。其中,该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH,正因如此该方法被称为碱裂解法,如果将其换为SDS,也能够提取出少量的质粒DNA,这是由于SDS也是碱性的,可以一定程度上破坏细菌的细胞膜。在这一方法中需要注意,NaOH溶液要现用现配,这个主要是由于其能够和空气中的CO2反应,从而使溶液的碱性降低,这样会影响提纯的效率,另外在加入溶液Ⅱ之后,操作时间不能够过长,这是因为染色体DNA在碱性条件下片段会慢慢断裂。另外需要注意的是,在操作过程中,混匀是一定要轻柔,从而在保证细菌沉淀可以充分的扩散在试剂中的前提下,避免已变性质粒DNA和染色体基因组DNA被机械剪切。此外,在溶液Ⅲ加入之后,其中的SDS会和蛋白质结合,会产生大量的沉淀,SDS还会和醋酸钾结合,生成PDS,这一物质的溶解度远低于SDS,从而可以将大部分蛋白质和染色体DNA共沉淀。
  2 煮沸法
  煮沸法的优点在于,能够在高菌体浓度的条件下进行质粒DNA的提取,应用这种方法可以是菌体裂解液浓度达到OD600等于100,能够达到碱裂解法的2.5倍。在进行质粒的提取时,提高提取效率十分重要,因此需要更提高处理样品的能力。在提取時,同一时间内,最好处理尽可能多的菌体,而菌体浓度比较高的情况下,可能会导致裂解不充分的问题,并增加后续操作的难度,影响到质粒DNA的提取效率和质量。通过煮沸法则可以有效的解决这一问题,这是特点也是煮沸法的主要优势所在。在传统的煮沸法中,裂解通常在100℃的热水浴中进行,如果温度过高的话,不仅难以控制好温度,同时会浪费比较多的能源。研究人员对煮沸法进行了优化,在连续热裂解方法中,增加了37℃温浴这一步骤,在热裂解之前先37℃温浴20min,在这样的条件下,裂解缓冲液中的溶菌酶以及Triton-X100可以充分的和菌体进行通,在这样的条件下,可以降低热裂解的温度,只需要70℃就可以满足要求,温度更加容易控制,而且能够节约能源。
  3 SDS裂解法
  SDS裂解法中,需要应用到3种裂解溶液,每种溶液的作用各不相同。其中,溶液Ⅰ的作用是对反应的pH值进行控制,通过控制pH值来使细胞壁溶解,从而增加细胞比重,从而使细胞悬浮起来;溶液Ⅱ的主要作用是使长链基因组DNA变性,并使其和蛋白质、细胞碎片等相互缠绕,最终形成大型的复合物,SDS会将这一复合物包覆起来,在这一过程中部分超螺旋的闭环环状质粒DNA也会出现可逆变性;在加入溶液Ⅲ之后,该溶液能够使整个系统恢复中性条件,从而使出现可逆变性的质粒DNA复性,同时接入溶液Ⅲ后,SDS还会和其中的醋酸钾出现反应,生成溶解度较低的PDS,从而使SDS包覆的大型复合物沉淀,离心之后就可以分离出质粒DNA。
  4 结论
  碱裂解法、煮沸法和SDS裂解法是比较常规的质粒DNA提取方法,其中,碱裂解法的特点是操作简便,提出的质粒DNA纯度较高,具有较高的提取效率,因此应用的比较广泛,应用此方法提取出的质粒DNA被广泛应用转化细菌、酶切分析以及DNA重组实验中;煮沸法则由于过程比较剧烈,容易导致质粒DNA结构的破坏,其优点是可以处理高浓度的菌液;SDS裂解法具有良好的提出纯度。
  参考文献:
  [1]刘辉.细菌质粒DNA基因的研究进展[J].北京医学,2007,29(2):101-103.
  [2]李卫玲,易初丽.质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展[J].江汉大学学报(自然科学版),2018,46(1):62-66.
  [3]李恒.大肠杆菌质粒DNA提取方法的研究[J].资源节约与环保,2018,199(6):86.
  作者简介:王佩菡(1997-),女,回族,山东济宁人,本科三年级,研究方向:健康科学。
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