奶牛性别控制试验的效果验证

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　　摘要：为满足畜牧生产需求，更有效地控制奶牛的后代性别，采用RNA干扰技术分别对2头成年健康繁殖性能正常的荷斯坦公牛Zfy基因mRNA进行干扰，应用SPSS 19.0统计软件进行卡方检验分析方法。结果显示，与对照组相比，干扰组公牛的后代性别比例发生明显的偏移，母犊比例达75%以上，而子代的体尺、生长发育及繁殖性能等均无变化。得出结论，干扰Zfy基因生产奶牛性控精液的方法简单、方便、易操作，在生产中具有一定的推广价值和应用前景。
　　关键词：奶牛;性别控制;试验;效果验证
　　中图分类号： S823.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0195-02
　　与Y染色体相关的锌指蛋白转录因子（Y chromosome linked Zinc-finger protein transcriptional factor，Zfy），是位于Y染色体短臂上的能够编码锌指蛋白的基因。Zfy基因参与哺乳动物的单倍体生精细胞的更新分化和发育，对于减数分裂和精子生成至关重要。Zfy与精子的形成与发生相关，作为一个较强的转录激活因子，引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作用[1-2]。1986年，Vergnaud等通过对Y染色体上有不同缺失的患者的DNA文库进行分子杂交，首次克隆获得了Zfy基因[3]。而睾丸决定因子最佳候选基因Sry被发现前，Zfy基因曾被认为是睾丸决定因子的候选基因[4]，在雄性睾丸生长发育过程中发挥重要作用[5-6]。彭强等首次用RNAi的方法通过构建Zfy基因siRNA重组表达载体进行小鼠体内RNAi的研究，从而研究编码Zfy基因在精子的生成过程中的作用，其后代出现雄性小鼠比例下降现象[7]。马军德通过逆转录病毒RNAi载体对小鼠进行性别控制产生了显著效果，在小鼠后代性别鉴定中绝大部分窝组的母鼠率都达到了70%以上[8]。本研究就Zfy基因干扰技术在奶牛性别控制中的应用进行简单的介绍。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 主要试剂与设备 酵母、蛋白胨、氯化钠、氨苄青霉素、无内毒素质粒提取试剂盒（北京天根生化有限公司）、无水乙醇、异丙醇、双抗（上海英骏生物技术有限公司）。
　　冷冻离心机、水浴锅、振荡器、摇床、恒温干燥箱。
　　1.1.2 试验动物 试验公牛来自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司种公牛站，随机选择系谱资料完整的健康荷斯坦种公牛2头，受配荷斯坦母牛均健康、成年，繁殖性能良好。
　　1.2 方法
　　1.2.1 重组表达质粒制备 将保存的菌种从-80 ℃超低温冰箱中取出，室温解冻后，超净台中将200 μL菌液接种至200 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培养基，摇床内37 ℃、8 000 r/min过夜培养。12～16 h后将处于对数期的菌液取出，按照无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒，测定浓度后-20 ℃保存备用。
　　1.2.2 Zfy基因mRNA表达水平检测 通过实时定量PCR（RT-PCR）检测重组干扰质粒pLL3.7-A、pLL3.7-B对奶牛生精细胞的Zfy基因mRNA表达水平的干扰效果，结果显示，与对照组（未做任何干扰处理）相比，奶牛生精细胞转染pLL3.7-A后Zfy基因mRNA表达水平显著降低了50%（P<0.05），转染质粒pLL3.7-B后Zfy基因mRNA表达水平降低了76%，与对照组差异极显著（P<0.01）（图1）。
　　1.2.3 公牛体内干扰试验 选取1头荷斯坦种公牛做对照，不做任何处理。选择干扰效果较好的质粒pLL3.7-B进行体内试验。将提取好的质粒用灭菌PBS滤液稀释，同时加入双抗以防止感染，然后按每管2.5 mg/5 mL的量对质粒进行分装。试验组公牛每侧睾丸注射剂量2.5 mg，沿睾丸纵轴进针，一边注射一边缓慢回抽针头，注射完毕拔出针头，碘酒消毒。试验公牛间隔7 d注射1次，共注射3次。第3次注射后第7天开始采精，以后每隔7 d采精1次，连续采精5次。收集精液，迅速检测精子活力和密度，然后制作0.25 mL的细管冻精，液氮中冻存备用。
　　1.2.4 奶牛配种 奶牛配种均采用人工授精技术，试验组（注射pLL3.7-B干扰质粒）和对照组分别配种母牛100头，试验组与对照组奶牛均在同一条件下饲养管理。
　　1.3 统计分析
　　数据采用SPSS 19.0统计软件进行Fisher（卡方检验）检验试验结果的差异显著性。
　　2 结果与分析
　　2.1 奶牛后代性别统计
　　对照组和试验组奶牛由专人负责管理，记录牛号、年龄、胎次、配种日期、产犊日期等，统计结果见表1。
　　由表1可知，對照组母犊率为51.58%，公母比例接近 1 ∶ 1，与生产实际中的正常性别比例相比差异不显著（P>0.05）;试验组母犊率高达75.26%，与生产实际中的正常性别比例相比差异极显著（P<0.01）。
　　2.2 奶牛体尺测量
　　随机选取试验公牛和普通公牛后代各5头进行体尺测量（体高、背高、肩高、十字部高、体斜长、体直长、胸围、管围、坐骨端高、腰角宽、头长、最大额宽、最小额宽、尻长），具体数据见表2。
　　由表2可知，试验组奶牛体尺与对照组奶牛体尺对应的各项指标差异不显著（P>0.05），说明性控奶牛生长发育正常，性控冻精可以进一步在生产中推广。
　　3 讨论
　　动物的性别决定机制与众多基因调控通路和机制相关联，人们往往通过研究性别决定的关键基因来调控动物性别和探究调控机制。Zfy基因曾被确定为性别决定候选基因。目前研究表明，尽管它不能直接决定睾丸的发育和原始生殖嵴的分化，但是它对于单倍体Y精子的发育起到关键作用。Y染色体上的特异基因Zfy对于Y精子头部和尾部的发育[9]、生殖细胞的减数分裂[10-12]、染色体联会交换的发生及染色体的失活[13]等起着重要的作用。 　　Zfy基因是位于Y染色体上的特异性基因，是染色体上编码锌指蛋白的基因，从减数分裂期开始表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Page等明确指出Zfy基因与性别分化、精子发生有关[14]。Zfy基因是Y染色体短臂上特异性单拷贝序列，一直以来人们针对Zfy基因的特异性主要集中在动物性别鉴定方面的研究，而利用该基因进行动物性别控制方面的研究仍为空白，本试验的开展将对家畜的性别控制技术开发提供新的思路和方法。
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　　收稿日期：2018-09-06
　　基金项目：2017年度新疆农业职业技术学院资助课题（编号：XJNZYKJ201704）;新疆生产建设兵团第十二师科技专项（编号：NYJH2013010）。
　　作者简介：席继锋（1978—），男，甘肃人，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：fftt2011@163.com。
　　通信作者：王香祖，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：173897302@qq.com。
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