帝王花种子无菌播种和快速繁殖研究

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　　摘要 [目的]建立帝王花无菌播种和快速繁殖技术体系。[方法]以MS或1/2MS为基础培养基，添加不同激素组合，筛选适宜的诱导、增殖及生根培养基。[结果]1/2MS+6-BA 0.01mg/L为帝王花种子最佳诱导培养基，培养14 d种子萌动，35 d形成幼苗;MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01mg/L为最适宜的增殖培养基，增殖倍数达2.83倍;1/2MS+IAA 1.00 mg/L为最佳生根培养基，生根率达96%，苗高达4.2 cm;将种苗栽植于泥炭∶珍珠岩=3∶1的基质上，其移栽成活率为85%。[结论] 该研究为快速繁殖帝王花優质种苗奠定了基础。
　　关键词 帝王花;无菌播种;激素配比;组织培养
　　中图分类号 S604文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）02-0067-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.018
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Study on Aseptic Sowing and Rapid Propagation Technology for Protea cynaroides L.Seed
　　CHEN Quan1，CHEN Hui-lan1，LI WEN-jian2 （1.Shanghai Sunqiao Modern Greenhouse Seed and Seedling Co.，Ltd.，Shanghai201210;2.Shanghai Sunqiao Yijia Agriculture Technology Co.，Ltd.，Shanghai201210）
　　Abstract [Objective] To establish a system of aseptic sowing and rapid propagation technology for Protea cynaroides L..[Method]Different hormone combinations were added to MS or 1/2MS medium to screen the suitable induction，proliferation and rooting medium.[Result]The proper medium for the seeds induction of Protea cynaroides L.was 1/2MS medium containing 6-BA 0.01mg/L，seed germination was observed on 14 days，seedling formation was observed on 35 days; the most suitableproliferation medium was MS medium containing 6-BA 1.00 mg/L+IBA0.01mg/L with proliferation times 2.83;the best seedling rooting medium was 1/2MS medium containing IAA1.00 mg/L，rooting rate was up to 96%，plant length was up to 4.2 cm;seedlings were planted in substrate that composed with peat and perlite in a ratio of 3∶1，the survival percent of transplantation could reach 85%.[Conclusion]The study laid a foundation for rapid breeding of high quality seedling of Protea cynaroides L..
　　Key words Protea cynaroides L.; Aseptic sowing; Hormones ratio; Tissue culture
　　帝王花（Protea cynaroides L.），又名菩提花，俗称木百合或龙眼花，是山龙眼科普洛蒂亚属多年生木本植物，两性花，头状花序锥形，基部有彩色的叶状苞片，花期常为秋季至翌年春末。帝王花是山龙眼花卉中最著名、最有经济价值的种类，也是世界上流行的新型高档木本切花[1-3]。帝王花原产南非，是南非共和国的国花，在园林装饰方面越来越受到大家的欢迎。帝王花既是优良的鲜切花，也适合制作干花，作为鲜切花可以摆放很长时间，因此受到世界上越来越多人的欢迎和喜爱，市场潜力巨大。帝王花通常采用播种繁殖，种子大多从国外进口，价格昂贵，加上种子具有休眠特性，用常规方法播种出苗率极低[4]，萌发周期也很长[5]，导致用种子繁殖生产成本较高。笔者也曾尝试采用成年帝王花植株茎杆进行组培，但帝王花属于灌木类，腋芽发芽困难，成活率低。而且在外植体诱导过程中很容易褐化，这与前人的研究结果一致[6-7]，因而不适合在生产上推广。故如何提高帝王花的繁殖率，加快从播种到成株的速度成为目前亟待解决的问题。
　　国外已有利用合子胚和子叶组织直接诱导帝王花体细胞胚胎研究的报道[8]。但尚未见利用无菌播种和组培快繁技术进行帝王花组培种苗工厂化生产方面的系统报道。笔者采用帝王花种子无菌播种获得的实生苗，取其子叶以上部分作为诱导不定芽的材料，并经过不断增殖，最终获得大量组培苗木。这种帝王花快速繁殖的方法，克服了常规繁殖方法所面临的问题，大大提高了帝王花种苗繁殖率，为进口苗木品种种苗的国产化提供了可靠的技术保障。笔者研究了帝王花种子无菌播种和快速繁殖，以期为快速繁殖帝王花优质种苗奠定基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料 帝王花种子从上海开普公司购得。
　　1.2 方法
　　1.2.1 种子消毒。将帝王花种子表面的黑色绒毛去除，在超净工作台上进行种子消毒。在清水中加入少量洗衣粉，用洗衣粉水将种子表面的污垢清洗干净，并在流水下冲洗干净。无菌条件下，用75%乙醇处理30 s，用0.05%HgCl2浸泡消毒10 min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干。待接种。
　　1.2.2 培养条件。使用240 mL广口瓶为培养容器（下同），每瓶灌装40 mL培养基，培养基中均添加白砂糖30 g/L、琼脂粉5 g/L，pH 5.8，培养温度（25±1）℃，光照强度2 500 lx。
　　1.2.3 无菌播种初代诱导培养。以MS或1/2MS为基本培养基，将消毒后的种子剥去种皮后接种于添加不同激素的MS萌发诱导培养基上，培养基配方：①MS;②MS+6-BA 0.01 mg/L;③MS+IBA 0.01 mg/L;④1/2MS;⑤1/2MS+6-BA 0.01 mg/L;⑥1/2MS+IBA 0.01 mg/L，观察不同培养基对帝王花种子萌发的影响。
　　1.2.4 增殖培养。以MS为基础培养基，切取无菌实生苗上胚轴及以上部分，接种于添加不同激素的增殖培养基上，培养基配方：①MS+TDZ 0.10 mg/L+IBA 0.01 mg/L;②MS+TDZ 0.20 mg/L+IBA 0.01 mg/L;③MS+TDZ 0.50 mg/L+IBA 0.01 mg/L;④MS+6-BA 0.50 mg/L+IBA 0.01 mg/L;⑤MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L;⑥MS+6-BA 2.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L。增殖培养继代周期为35 d。连续继代3次后，统计种苗第4次继代的增殖倍数。种苗增殖倍数=培养35 d时植株数/接种时种苗数。
　　1.2.5 壮苗生根培养及炼苗。将增殖培养基中高度2 cm的单株切下，以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度IBA、IAA（0、0.20、0.50、1.00、1.50 mg/L），壮苗生根培养42 d，统计苗高、生根率。将完成生根过程的瓶苗预先放到温室内，散射光下炼苗7 d，然后从培养瓶中取出植株，洗净培养基，用700倍多菌灵浸泡2 min后，移栽于泥炭土：珍珠岩=3：1的混合基质中，搭小拱棚用薄膜覆盖，空气湿度保持80%以上，环境温度16～26 ℃。
　　1.3 数据分析 采用Excel 2007对试验数据进行统计和分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 无菌播种初代诱导培养
　　帝王花种子表皮外有黑色绒毛包裹，影响种子消毒效果。直接剥取种子胚接种于播种培养基上，35 d形成幼苗。培养5 d左右，胚逐渐吸水膨胀，14 d时，种子开始萌动转绿。处理①～⑥种子均能正常萌动，其中处理②和⑤萌动稍快，而处理⑤后期长势快且好，植株生长健壮。以处理⑤1/2MS+6-BA0.01 mg/L为帝王花种子诱导最佳培养基，种子萌发率达100%。
　　2.2 增殖培养 将初代诱导培养的帝王花种苗接种于各增殖培养基上，经过3次连续继代，统计观察第4次继代后的增殖及生长情况。由表1可知，在含TDZ的3个处理中，随着TDZ浓度的提高，帝王花种苗增殖倍数逐渐提高，处理③最高达2.96倍，但形成的芽小而弱，且少量叶片肥厚而脆弱，有玻璃化的趋势。在含6-BA的3个处理中，处理⑤增殖倍数最高，达2.83倍，芽长势好且粗壮。随着激素浓度的进一步提高，出现玻璃苗现象，处理⑥增殖倍数为2.66倍，增殖比例反而降低。从6-BA与TDZ对帝王花组培苗不定芽的诱导效果看，在含6-BA的增殖培养基中诱导的不定芽粗壮且生长速度快，芽伸长生长明显。在含较高浓度TDZ的增殖培养基中诱导的不定芽数量虽然最多，但诱导的芽弱且芽伸长生长缓慢。综合比较后认为，在实际生产中MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L为最适宜的增殖培养基。
　　2.3 壮苗生根培养及驯化移栽
　　由表2可知，生长素（IAA、IBA）浓度低于0.50 mg/L时，帝王花组培苗生根率较
　　低。生长素浓度在0～1.00 mg/L时，随着浓度的提高，生根率逐渐提高，植株高度也呈现相同变化，差异极显著。相同浓度下，IAA的生根效果优于IBA。当IAA浓度为1.00 mg/L时，生根率最高达96%，植株高度达4.2 cm。无论是IAA还是IBA，当浓度高于1.00 mg/L时，生根率和植株高度反而有所降低。综上所述，1/2MS+IAA1.00 mg/L为最佳壮苗生根培养基，当植株接种于此壮苗生根培养基后，14 d后陆续长出新根，35 d后生根率达96%，植株高度达4.2 cm。瓶内生根的植株经过7 d炼苗后，移栽于泥炭土∶珍珠岩=3∶1的混合基质中，移栽成活率达85%。
　　3 讨论
　　帝王花常规的种子发芽方法发芽所需时间长，发芽率低。因此种子无菌播种和快繁技术研究对解决帝王花种苗的繁殖具有重要意义。在可控的环境条件下，种子萌发率大大提高，因而无菌播种的优势明显。周辉明等[9]对垂花蕙兰种子无菌播种和快速繁殖进行研究，结果认为适宜外源激素的添加能促进种子萌发，林辉锋等[10]研究石橄榄种子无菌播种和快速繁殖，发现外源激素的添加更能促进石橄榄种子萌动。该研究得出相似结论，在种子萌发培养基中添加微量细胞分裂素能促进帝王花种子萌发，利于培育健壮植株，适宜的种子无菌播种培养基为1/2MS+6-BA0.01 mg/L。
　　在帝王花的增殖培养中发现，在基本培养基中添加不同的细胞分裂素，增殖效果有明显差异。在添加6-BA的增殖培养基中诱导的不定芽数量少，芽粗壮且生长速度快，芽伸长生长明显，而在添加TDZ的增殖培养基中诱导的不定芽数量多，芽弱且芽的伸长生长受到抑制。任鹏斌等[11]在研究TDZ与6-BA对魔芋不定芽誘导效应时发现，TDZ对魔芋不定芽的伸长生长表现出较强的抑制作用，而6-BA对不定芽的伸长生长则表现出较好的促进作用，该研究得出了与前人相同的研究结果。可见，不同的细胞分裂素种类和浓度，对于帝王花不定芽的分化、增殖效果不同。在生产过程中，结合种苗增殖的实际情况，6-BA和TDZ可交替使用。 　　在植株壮苗生根阶段，较高浓度的生长素有利于帝王花组培苗生根，这可能与帝王花种苗内源生长激素较低有关。相同浓度下，IAA对帝王花种苗的瓶内生根效果优于IBA。该研究条件下1/2MS+IAA 1.00 mg/L为最佳壮苗生根培养基，当植株接种于此壮苗生根培养基后，14 d后陆续长出新根，35 d后生根率达96%，植株高度达4.2 cm。该研究还发现，NAA对帝王花的生根无明显的促进作用。
　　移栽成活率是影响组培种苗工厂化生产成本的关键因素之一。在获得较为健壮种苗的基础上，通过加强移栽后温湿度的管控，提高种苗移栽成活率。该研究中瓶内生根的植株经过7 d炼苗后，移栽于泥炭土∶珍珠岩=3∶1的混合基质中，移栽成活率达85%，种苗长势良好。
　　4 结论
　　该研究以帝王花种子为试验材料，研究了不同激素及其浓度对帝王花种子萌发、芽增殖、壮苗生根的影响，筛选出了适宜的诱导、增殖及壮苗生根培养基配方，建立了一套帝王花种子无菌播种和快速繁殖技术体系，具有种子萌发率高、芽增殖系数高、生根效果好、移栽成活率高等特点。该研究为帝王花种苗工厂化生产提供了可靠的技术保障，同时对于进口苗木品种种苗的国产化研究具有重要意义。
　　参考文献
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