阿胶粗多糖脱蛋白方法比较及抑制酪氨酸酶活性研究

来源:用户上传      作者:刘春媛 廖峰 汝文文

　　摘要 [目的]研究阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]针对阿胶多糖提取中蛋白质的干扰，通过对几种脱蛋白方法（TCA法、Sevage法、蛋白酶法）的比较，优选出阿胶多糖提取液的脱蛋白方法，并探讨阿胶多糖对酪氨酸酶的抑制作用。[结果]TCA法、Sevage法及蛋白酶法的脱蛋白率分别为78.94%、87.73%和29.97%，多糖保留率分别为73.96%、32.14%和72.57%。所得阿胶多糖对酪氨酸酶有一定的抑制作用，当浓度为1 mg/mL时，抑制率为24.42%。[结论]TCA法脱蛋白率较高、多糖损失率较低，筛选方法可有效去除阿胶粗多糖中的蛋白，所得阿胶多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用。
　　关键词 阿胶;多糖;脱蛋白方法;蛋白纯化;酪氨酸酶
　　中图分类号 R966 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0182-03
　　Abstract [Objective] The research aimed to study the separation and purification process of crude polysaccharide of donkeyhidegelatin and its inhibition of tyrosinase activity.[Method] Aiming at the interference of protein in the extraction of donkeyhidegelatin polysaccharides，the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized by comparing several deproteinization methods（TCA method，Sevage method and protease method），the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized，and the inhibitory effect of donkeyhidegelatin polysaccharide on tyrosinase was discussed.[Result]The deproteinization rates of TCA，Sevage and protease were 78.94%，87.73% and 29.97%，respectively，and the polysaccharide retention rates were 73.96%，32.14% and 72.57%，respectively.The obtained gelatin polysaccharide had a certain inhibitory effect on tyrosinase.When the concentration was 1 mg/mL，the inhibition rate was 24.42%.[Conclusion]The TCA method has higher deproteinization rate and lower polysaccharide loss rate.The screening method can effectively remove the protein from the crude polysaccharide of donkeyhidegelatin，and the obtained donkeyhidegelatin polysaccharide has a good inhibitory effect on tyrosinase.
　　Key words Donkeyhidegelatin;Polysaccharide;Deproteinization methods;Protein purification;Tyrosinase
　　多糖作为构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于自然界动植物等有机体中[1]，其含有多羟基和羧基结构，可与水分子形成氢键网络而锁住水分，从而具有保湿作用[2]。多糖能够抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的生成，从而达到美白功效[3]。一些大分子多糖可激活并增强机体内SOD等抗氧化物酶活性，达到抗氧化功效[4]。此外，多糖還具有皮肤组织修复作用、抗衰老作用等[5]，因其有较高的安全性，被广泛应用于化妆品中。
　　阿胶作为补血补虚、滋补强壮的良药，自《神农本草经》以来一直沿用至今，在我国已有3 000多年的历史，无论是单方使用，还是用于复方配伍，都有着丰富的记载[6]。阿胶味甘、性平，归肺、肝、肾经，具有补血滋阴、润燥、止血之功效，被历代医家尊称为补血“圣药”[7]。阿胶中的多糖虽然部分是外源性添加，且含量相对其他成分较低，但是其在加工过程中经过高温熬煮，可与蛋白质等成分发生化学反应，产生不可预知的生物学修饰。近年来虽然对植物多糖的报道较多，但是阿胶多糖在化妆品领域的应用少之甚少，仍处于研究阶段。笔者对阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性进行研究，为后期将阿胶多糖分子开发为化妆品功效成分奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试材
　　阿胶（批号1707038），东阿阿胶集团提供;无水乙醇、三氯乙酸、浓硫酸、氯仿、正丁醇，国药集团化学试剂有限公司;苯酚，Macklin;葡萄糖，Sigma;BCA蛋白浓度测定试剂盒，天根;L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷，北京索莱宝科技有限公司。
　　1.2 仪器
　　VO400真空干燥箱，Memmert公司;MX-S涡旋振荡器，SCILOGEX公司;MS-H280-Pro磁力搅拌器，SCILOGEX公司;MULTISKAN GO多功能酶标仪，Thermo公司;UV-1800紫外分光光度计，岛津;ML303分析天平，梅特勒公司。 　　1.3 试验方法
　　1.3.1 多糖含量测定。
　　采用苯酚-硫酸法[8]测定多糖含量，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线的回归方程：y=0002 3x+0.064 5（R2=0.999 24，n=3）。
　　1.3.2 蛋白质含量测定。
　　采用BCA法[9]测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白作标准品，在595 nm处测定吸光度，标准蛋白质浓度在0～500 μg/mL与吸光度有较好的线性关系，回归方程为y=0.555 63x+0.066 40（R2=0.999 66，n=3）。
　　1.3.3 阿胶粗多糖成分提取。
　　取一定量的阿胶样品，以料液比1∶10加入蒸馏水，80 ℃水浴浸提2 h，离心取上清液，加入无水乙醇进行醇沉，乙醇终浓度至90%，搅拌均匀，于4 ℃静置过夜后，离心取沉淀，于真空干燥箱中进行干燥，称重。取0.4 g粗多糖溶于40 mL蒸馏水，测定多糖含量。
　　1.3.4 不同脱蛋白方法。
　　1.3.4.1 TCA法。
　　取“1.3.3”提取的粗多糖溶解于蒸餾水中，离心取上清液，分别加入60%三氯乙酸溶液，至终浓度为5%、15%、30%，混匀后于4 ℃静置过夜，离心弃去沉淀，测定上清液中蛋白和多糖浓度。
　　1.3.4.2 Sevage法。
　　取“1.3.3”中的粗多糖溶于蒸馏水中，离心取上清，粗多糖溶液和Sevage（氯仿∶正丁醇=4∶1）以4∶1比例混匀，剧烈振荡20 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，反复多次至两相界无变性蛋白出现。
　　1.3.4.3 蛋白酶法。
　　取一定量粗多糖溶于蒸馏水中，离心取上清，分别加入不同酶活力单位的木瓜蛋白酶溶液，调节pH为6.0，混匀后于60 ℃酶解2.5 h，反应结束后沸水浴10 min，冷却至室温，3 000 r/min离心10 min，离心弃去沉淀，测定上清液中蛋白和多糖浓度。
　　1.3.5 酪氨酸酶活性抑制试验。
　　分别取1 mL不同质量浓度的阿胶多糖溶液（以磷酸缓冲液为空白，对照品为熊果苷），与1.66 mmoL的L-酪氨酸混合，37 ℃下孵育5 min，加入酪氨酸酶（900 U）250 μL，37 ℃下孵育10 min，475 nm波长处测定吸光度，计算酪氨酸酶活性抑制率。
　　1.3.6 计算公式。
　　蛋白清除率=脱蛋白前A562-脱蛋白后A562脱蛋白前A562×100%（1）
　　多糖保留率=脱蛋白后多糖A490脱蛋白前多糖A490×100%（2）
　　综合评分=0.5×（多糖保留率多糖保留率最大值+蛋白质清除率蛋白质清除率最大值）×100（3）
　　酪氨酸酶抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%（4）
　　其中，A为未加样品而加酪氨酸酶的混合液;B为未加样品、酪氨酸酶的混合液;C为加样品、酪氨酸酶的混合液;D为加样品而未加酪氨酸酶的混合液。
　　2 结果与分析
　　2.1 阿胶样品多糖、蛋白质测定
　　采用硫酸-苯酚法测得阿胶样品中多糖含量为26 mg/g，BCA 法测得蛋白质含量为435 mg/g;阿胶粗多糖样品的多糖含量为35 mg/g，蛋白质含量为324 mg/g。
　　2.2 不同脱蛋白方法比较
　　以蛋白清除率和多糖保留率为评价指标，采用TCA法、Sevage法和蛋白酶法对阿胶粗多糖溶液进行脱蛋白处理。
　　2.2.1 TCA法。
　　TCA作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀。由图1可知，随着TCA终浓度的增加，蛋白质清除率逐渐增大后达到基本平衡。TCA浓度为5%时，因其只能结合多糖中的一部分蛋白质，蛋白质清除率低，仅为27.94%;随着TCA浓度的增大，蛋白质脱除率逐渐增大，多糖保留率也随之降低，这可能是低浓度TCA脱蛋白时，蛋白质沉淀过程中会吸附或夹带部分多糖而造成多糖损失[10];当高浓度TCA沉淀蛋白质时，不仅使游离蛋白质沉淀下来，而且会沉淀多糖溶液中的部分糖蛋白，并引起部分多糖的降解，导致多糖保留率降低[11]。亦或者是TCA对阿胶多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，结构受到影响，经TCA法脱蛋白的多糖复溶性变差，而且这种破坏作用随着TCA浓度增大而增强[12]。综合考虑，当TCA浓度为25%为佳，此时，蛋白质清除率为78.94%，多糖保留率为7396%，此时综合评分达到最大值。
　　2.2.2 Sevage法。
　　由图2可得，随着脱蛋白次数的增加，阿胶粗多糖蛋白去除率升高，多糖保留率逐渐减小。当利用Sevage法对阿胶多糖脱蛋白5次脱蛋白处理后，蛋白质去除率仅为37.83%。经过15次脱蛋白处理后脱蛋白率可增至79.38%，但是随着脱蛋白次数的增加，蛋白去除率较之前增长不大，但多糖保留率却逐渐下降。经20次脱蛋白仍有蛋白质残留并且多糖保留率不高。可能是由于阿胶在熬制过程中，部分蛋白质与阿胶多糖结合过于紧密或糖蛋白的存在[13]，或者多糖吸附在蛋白表面，重复操作造成多糖流失所致[14]。综合考虑，处理15次时评分达到最大值，用Sevage试剂处理多次后，蛋白质脱除率明显提高，但多糖损失较多，影响多糖保留率。
　　2.2.3 蛋白酶法。
　　在底物浓度一定的情况下，酶解反应速度与木瓜蛋白酶浓度成正比。因此随着酶浓度的增大，酶解反应速率提高。由图3可知，随着木瓜蛋白酶添加量的增加，阿胶多糖溶液的脱蛋白率逐渐增大，这可能是因为阿胶粗多糖溶液中的蛋白质作为木瓜蛋白酶的作用底物，随着酶浓度的增加，酶反应速率加快，蛋白质脱除效果不断上升[15]。当酶浓度大于500 U/mL时，酶用量的增加对脱蛋白率影响不大，多糖保留率随着酶用量的增加呈缓慢降低趋势。可能是由于酶已达到饱和状态，过量的酶聚集在有限的底物上，反而降低了酶的利用率[16]。从综合评价来看，木瓜蛋白酶浓度为 500 U/mL时评分值达到最大，此时蛋白质脱除率为29.97%，多糖保留率为72.57%。在阿胶粗多糖量一定的条件下，增大酶用量，酶解效率提高使得脱蛋白率增大。但考虑阿胶本身为水解蛋白，因此木瓜酶法脱蛋白亦不适用于阿胶粗多糖提取。 　　2.2.4 脱蛋白方法的比较。经水提纯沉法得到阿胶粗多糖，得率为43.3%。阿胶粗多糖经3种不同纯化方式脱蛋白（图4），Sevage法蛋白脱除率为87.73%，多糖保留率为3214%，纯化多糖蛋白质去除率较高，多糖较纯，但是其过程繁琐;酶解法蛋白质清除率为29.97%，多糖保留率为7257%，蛋白质去除率不理想。考虑阿胶本身为水解蛋白，再次水解效果也不理想，相比较TCA蛋白质清除率为7894%，多糖保留率为73.96%，此法简单有效，可作为工业化生产方案。
　　2.3 酪氨酸酶活性抑制分析
　　通过阿胶多糖对酪氨酸酶的活性抑制能力来评价阿胶多糖的美白功效，阿胶多糖对酪氨酸酶活性抑制率如图5所示。阿胶多糖对酪氨酸酶活性具有抑制作用，并呈一定的浓度依赖性。当阿胶多糖质量浓度为1 mg/mL时，对酪氨酸酶活性的抑制率达24.42%。因此，阿胶多糖具有抑制酪氨酸酶的活性、阻断黑色素生成的能力。
　　3 結论
　　通过采用TCA法、Sevage法、木瓜蛋白酶法3种方法，对阿胶多糖脱蛋白方法进行比较，结果表明，TCA法的脱蛋白效果较好，蛋白质清除率为78.94%，多糖保留率为73.96%;Sevage法次之，蛋白脱除率为87.73%，多糖保留率为3214%;蛋白酶法较差，蛋白质清除率为29.97%，多糖保留率为72.57%。Sevage法纯化多糖蛋白质去除率较高，多糖较纯且条件温和，虽不会引起多糖的变性，但其采用的有机溶剂毒性较大，过程繁琐，耗时耗能，考虑安全性和工业化生产程序不推荐该方法。酶解法除蛋白效率不高，考虑阿胶本身为水解蛋白，再次水解效果不理想，亦不推荐。TCA法能够将大部分蛋白去除，简单可行。经初步纯化制得的阿胶多糖对酪氨酸酶有一定的抑制作用，在浓度为1 mg/mL时，酪氨酸酶抑制率为24.42%。由此可见，经该研究筛选的脱蛋白方法切实可行，制得的阿胶多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用，为阿胶多糖投入到食品、保健品以及化妆品生产提供理论参考。
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