金线莲组织培养研究进展
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作者:李荣峰 粟杨盛
摘要 金线莲是一种多年生草本药用植物，野生资源已逐渐枯竭，人工栽培能为金线莲的产业化发展提供充足的材料。从金线莲的人工繁殖、金线莲组培茎段和顶芽外植体选取、外植体消毒、培养基（基本、诱导、生根）选择等几方面进行了综述，同时分析了金线莲组织培养中存在的问题，并指出今后金线莲的研究重点。
关键词 金线莲;组织培养;研究进展
中图分类号 S567.23 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）03-0015-03
Abstract Anoectochilus roxburghii is a perennial herbaceous medicinal plant.The wild resources have been gradually depleted.Artificial cultivation can provide sufficient materials for the industrial development of A.roxburghii.This paper reviewed the artificial breeding of A.roxburghii，the selection of the stem segments and top bud explants of A.roxburghii，the disinfection of explants，and the selection of medium （basic，induction，rooting）.The problems in the tissue culture of A.roxburghii were analyzed，and the research focus of A.roxburghii was pointed out in the future.
Key words Anoectochilus roxburghii;Tissue culture;Research progress
金线莲（Anoectochilus roxburghii），别名金线兰、金丝草、金丝线、金耳环、乌人参、金线虎头蕉、金线入骨消、金线石松、金石蚕、少年红、小叶金耳环、麻叶菜等， 是兰科开唇兰属植物的多年生草本药用植物，因其叶脉呈金黄色而得名。成分分析研究发现，金线莲富含糖类成分（多糖13.326%，低聚糖11243%，还原糖9730%）、牛磺酸、强心甙类、酯类、生物碱、甾体，多种氨基酸，微量元素及无机元素等[1-6]，金线莲氨基酸和微量元素两者含量均高于国产西洋参和野山参，它们与牛磺酸、多糖类成分具有营养、抗衰老、调节人体机体免疫的作用。近年来在台湾地区和东南亚一些国家金线莲热销，其原药材供不应求，但由于金线莲对生态环境要求严格，加之近年自然环境严重破坏，自然资源本来就不多以及过度采挖，造成金线莲野生资源逐渐枯竭[7]，目前已经到了濒临灭绝的程度。现今，利用不同外植体材料和方法完成金线莲离体再生已获得成功[8-10]。许多科研工作者也投入了大量的时间和精力，试图通过改善培养基组成和成分配比来缩短金线莲组培中继代时间、提高根系质量和生根效率，但始终未能获得实质性的突破[11-13]。前人已分别系统综述了金线莲化学成分分析、外植体筛选、培养基组分、不同移栽条件、条件优化及无土栽培技术、人工种子制作及人工栽培条件等[14-19]，笔者拟重点介绍金线莲人工繁殖、金线莲组培茎段和顶芽外植体选取、外植体消毒、培养基（基本、诱导、生根）选择等，同时分析存在的问题及将来可能的突破点。
1 金线莲人工繁殖
金线莲人工繁殖目前得到很大的发展，主要有种子繁殖、分根法或扦插法繁殖、组织培养繁殖。种子繁殖时由于金线莲种子微小，自然萌发率极低，只有在无菌条件下供给充足的养分，种子才能萌发;以分根法或扦插法繁殖，繁殖系数极低，在量上无法形成规模;而利用组织培养方法，可以在较短时间内获得大量种苗，这是目前保护和开发金线莲的唯一途径。
2 金線莲组培外植体的选取
选择和确定合适的外植体是进行离体培养的基础，同一植物不同部位有不同的特点，因此必须分析同一植物不同部位的生长状况，寻找确定满足培养目的的植物部位。金线莲组织培养时，可用其茎段、顶芽、种子、叶片作为外植体，以茎段、顶芽组培效果较好。
2.1 茎段作外植体
李海鹰等[20]选取金线莲不同部位茎段进行丛生芽诱导，发现金线莲不同部位茎段不定芽的诱导结果存在较明显的差异，其中又以不含顶芽和根的中间带节茎段较好，不定芽的增殖率都在4倍以上。江建铭等[21]以金线莲茎段为外植体研究金线莲组织快繁，结果表明外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好。吴坤林[22]对金线莲快繁的研究也证明了这一点，上部的茎段因含有顶芽，顶端优势表现较为强烈，以高生长为主，不定芽发生较少;中部茎段不定芽均从叶痕节中发生，并不断分枝，形成多枝丛生芽;下部茎段由于组织老化，再生能力差，虽有不定芽发生，但发生和生长缓慢。祁永琼等[23]对金线莲不同外植体组培，基部茎段在培养基中增殖产生的幼苗较为细弱，黄化苗率为34.5%;顶芽在培养基中增殖产生的幼苗都较健壮，没有黄化苗产生;中部茎段增殖产生的幼苗生长情况则介于基部茎段和顶芽之间。
相比较而言，基部茎段增殖率一般，高于顶芽，低于带节中间茎段，产生的幼苗黄化苗率高且弱小，需要壮苗培养后才可进行生根培养;顶芽在培养基中增殖产生的幼苗都较为健壮且没有黄化苗，可直接进行生根培养，但增殖率较中间带节茎段低;中部带节茎段黄化苗不多，增殖率高且幼苗也够健壮，是金线莲组织培养理想的外植体。
2.2 顶芽作外植体
在顶芽和侧芽的组培过程中，金线莲的个体发生途径是由体细胞胚发育成类原球茎，往后发育的进程与种子胚的形态建成途径相似。顶芽和侧芽也可直接启动，形成丛生芽，再诱导生根成苗。还可用金线莲叶片或不带芽的茎段作外植体，首先要经过脱分化形成愈伤组织，再沿不同的途径成苗。金线莲的种子非常细小，呈翅状， 是由一个简单的胚和单层细胞的种皮组成;种子萌发时首先是胚膨大，然后种皮破裂，经过40 d，可见浅黄色呈球状的原胚，被称为原球茎[24]。张铁等[25]通过滇越金线莲种子无菌萌发后得到的原球茎经分化成幼苗，发现其在Hyponexl培养基上萌发速度快，萌发率最高，达70%，原球茎的生长状况最好。金线莲组织培养以成年植株上取得茎段和茎尖组织为主要培养材料，以带节茎段或顶芽接种于培养基上培养10 d后，可见到带节的茎段膨大，腋芽萌动生长，突起并伸长， 呈白色;培养25 d后，腋芽继续伸长，并从基部增生出新的芽体后长成小苗，基部的新芽上又产生新的芽点，经过不断的继代培养后形成大量丛生芽[26]。黄德贵等[27]在对金线莲丛生芽的研究中发现，金线莲带节茎段经培养能得到大量种苗。节段的腋芽分化过程中，有腋（侧）芽萌生和原球茎增殖两途径。以固体培养基培养带节茎段，90 d后侧芽再生，其最高的繁殖倍率平均达5.1倍。祁永琼等[23]选用金线莲的顶芽、中部茎段以及基部茎段作为材料，研究金线莲组织培养快速繁殖成苗技术，以顶芽作为外植体时，诱导率和增殖倍数都是最高的;增殖培养时，这3种外植体的增殖率都较高，其中顶芽增殖倍数达7.5倍。 3 外植体的消毒
由于同一植物不同部位有其不同的结构特点，各种激素成分含量也有差异，它们对于不同种类和浓度消毒剂的反应也不相同，开始都要对使用的消毒剂种类、浓度和消毒时间进行试验研究，以达到最佳的消毒效果。在对金线莲外植体进行消毒灭菌处理方法的研究中用到的消毒剂有78%乙醇、2.0%次氯酸钠、0.1%HgCl2溶液等，处理时间的长短也有差异。黄德贵等[9]用0.1%HgCl2浸泡3 min， 再用12%漂白粉液消毒10 min，双重消毒金线莲外植体，材料的污染率为0，芽萌动率达85%。王建明等[16]对金线莲外植体消毒灭菌条件进行了优化，其中以75%乙醇+0.1%HgCl2浸泡处理8 min效果较好。阚世超等[28]用75%乙醇消毒30 s+0.15%HgCl2消毒4 min，启动金线莲外植体的培养，污染率为0.001且褐变率只有0.05。
不同学者及研究人员对金线莲外植体消毒要求不同，所选择的试剂、浓度和消毒时间也不尽相同。0.1%HgCl2漫泡3 min+12%漂白粉液处理10 min污染率较低且萌发率良好;用75%乙醇和0.1% HgCl2浸泡处理8 min，萌發率较高，但是污染率较高;用75%乙醇消毒30 s+0.15%HgCl2消毒4 min，污染率及褐变率都较低。
4 培养基的选择
4.1 基本培养基的选取
根据已有的报道，金线莲培养所用的基本培养基有MS、1/2MS、B5和N6等。MS培养基诱导茎段产生芽体的能力比1/2MS培养基强，而诱导顶芽产生新芽体的能力反而是1/2MS更强一些[29]。刘伟等[30]在比较了20种培养基诱导茎段丛生芽的效果后，发现MS作为基本培养基的效果较佳。也有学者以改良MS或B5培养基作为诱导分化的基本培养基。高燕等[31]用MS培养基改良为Ar培养基（大量元素减半，微量元素加倍，pH5.8，蔗糖2%，琼脂粉0.7%）培养金线莲带腋芽茎段，获得了良好的效果。王建勤等[32]在对金线莲原球茎进行诱导时用KC、VW和MS进行对比试验，KC和VW培养基都没有诱导产生原球茎，而MS培养基上原球茎的诱导率为60%。毛碧增等[29]比较了金线莲茎段在18种基本培养基诱导丛生芽的效果，表明在MS培养基中添加BA 1.5 mg/L、NAA0.15 mg/L为诱导茎段的最佳组合。刘芳等[33]研究了金线莲不同部位外植体在不同基本培养基中诱导丛生芽，结果表明在MS培养基上，金线莲中部茎段诱导产生丛生芽的效果好，在N6基本培养基上，诱导金线莲基部茎段产生丛生芽的效果好。曹天旭等[34]研究外部因子对金线莲丛生芽增殖和发根的影响也得到了类似的结果。金线莲组织培养再生成苗主要有原球茎、丛生芽等途径，不同途径以及不同部位外植体所需培养基不同，具体情况如表1所示。
4.2 诱导培养基的选取
组织培养中常用到的植物生长调节剂有生长素、细胞分裂素、赤霉素以及其他化合物等。植物生长调节剂的种类、配比不同对培养物的影响具有显著性差异。一般来说，生长素浓度高于细胞分裂素浓度有利于生根培养;细胞分裂素浓度高于生长素浓度容易诱导产生新芽;生长素浓度与细胞分裂素浓度相当时常用于愈伤组织的诱导。何云芳等[35]试验表明，BA 4.0 mol/L，NAA0.3 mol/L和GA30.3 mol/L时，对丛生芽产生和伸展的效果较好。高燕等[31]研究发现，金线莲对6-BA不敏感，当培养基中的6-BA浓度达4.0 mg/L时未出现畸形苗，但是在金线莲培养过程中6-BA具有积累效应，应根据幼苗的长势来确定6-BA用量;金线莲增殖培养时，在培养基中加入一定量的KT可以促进丛生芽的分化和增殖。王建勤等[32]在研究诱导金线莲原球茎与植株再生时配合使用细胞分裂素、玉米素和生长素提高了原球茎诱导率。S-3307是一种新型高效的植物生长调节剂，有抑制赤霉素生物合成的功能，具有促进植株分蘖、抑制植物生长的作用，在金线莲原球茎增殖培养时，加入一定量的生长抑制剂能提高增殖率。而TDZ有很强的细胞分裂活性（CTK），有促进植物芽再生和繁殖的能力，并且能打破芽的休眠，还可用来调节植物的生长发育。杨柏云等[36]在诱导金线莲原球茎的培养基中加入不同浓度的NAA、TDZ和S-3307，发现其对原球茎分化作用大小依次为TDZ>S-3307>NAA。江建铭等[21]以茎段为外植体开展生长调节剂对不定芽增殖、幼苗生长的影响研究，不定芽增殖时MS培养基添加BA3.0 mg/L+NAA0.5～1.0 mg/L，60 d增殖倍数高达5.0以上;壮苗时MS培养基添加NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+香蕉提取物20%（或椰子汁20%）的效果良好。曹天旭等[34]在BS培养基中加入5 mg/L BA，金线莲丛生芽增殖及植物生长最显著。杨柏云等[36]以金线莲茎段为外植体，在MS培养基中加入不同浓度的6-BA、NAA、TDZ和S-3307，研究表明在诱导原球茎时，在MS培养基中加入TDZ 0.4 mg/L和NAA0.2 mg/L，诱导率达93.3%;原球茎增殖时MS培养基添加6-BA2.0 mg/L、S-3307 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L，增殖系数达9.4;芽分化时MS培养基添加S-3307 1.5 mg/L、TDZ 0.4 mg/L、NAA1.5 mg/L和琼脂0.7%，分化率达91.7%;生根培养基1/2MS添加NAA0.2 mg/L、活性炭0.05%和琼脂0.7%，生根系数达4.4。黄勇[37]以滇越金线莲和花叶开唇兰2个金线莲品种种子为材料进行无菌萌发，结果表明，滇越金线莲和花叶开唇兰在MS（不加大量元素）+花宝13 g/L+椰子汁10%中无菌萌发情况良好;在MS（不加大量元素）+花宝13 g/L+蛋白胨2 g/L+香蕉汁100 g/L+活性炭5 g/L的固液体培养基中交替进行继代培养生长速度快、增殖系数高且炼苗移栽后存活率高、生长情况良好。研究人员得出的金线莲最适诱导培养基生长调节剂配比见表2。 4.3 生根培养基的选取
通过组培快繁得到的金线莲组培苗需要经过培育，待生长健壮、有一定高度、发根时才能进行人工栽培金线莲。陈永快等
[38]对台湾金线莲与福建金线莲组织培养的研究表明，在生根培养中，不同生长调节剂对不同金线莲品种的生根影响基本一致，所以可以不考虑金线莲品种对生根培养的影响。黄德贵等[39]通过对比22个配方，在1/2MS+NAA4 mg/L+IBA1 mg/L+活性炭0.3%的组合培养基上培养90 d，壮苗生根效果良好，植株平均可净增高3.38 cm、叶3.29片、根2.5条、鲜重达0.5 g。高燕等[31]对金线莲生根培养基进行筛选发现，在Ar+糖3%+AC0.2%+琼脂粉0.7%，pH5.8的培养基中加入IBA0.5+NAA0.5或IBA 0.5+NAA1.0，不定根的生根率达 100%，平均每株根的数量为3.8～4.0条，不定根平均伸长2.8～3.1 cm，幼苗粗壮，生长良好，看出一定量的NAA和IBA对不定根的诱导有促进作用。曹天旭等[34]研究IBA对金线莲发根的影响，结果表明金线莲发根较为容易，在MS基本培养基中加5 mg/L IBA，根的生长旺盛。周玉美等[40]、魏翠华等[41]证明蔗糖是影响金线莲生根的重要因素，蔗糖对产生根的数量影响较大，却往往容易被忽略。金线莲在节间隙之间会生长出气生根，所以在生根培养时容易产生根，在培养基中添加一定量的蔗糖、 IBA和NAA能有效地促进金线莲生根。
5 问题及展望
金线莲经过组织培养获得的脱毒苗不受季节限制，繁殖速度快于普通育苗方法，而且组培苗在阶段发育上比普通育苗法获得的幼苗健壮。经过学者和研究人员试验研究建立起的完善的金线莲组织培养体系，可以用于工厂大规模化生产的重要理论依据。运用组织培养技术能有效地对我国金线莲种质资源进行保护和开发利用，但还有很多问题有待解决：①组织培养过程中应进一步控制污染率、黄化率，并进一步提高移栽存活率;②目前研究的是不同品种金线莲的快速繁殖体系，缺乏同一品种在组织培养中的理论依据和归纳总结;③虽然通过组织培养技术获得了大量无性幼苗，但是新品种选育和研究有待进一步深化。
未来金线莲的研究发展有望在以下几方面获得突破：①建立统一的相应品种研究体系，为展开品种选育以及基因改造等提供技术支持与理论依据;②增强对组织培养获得的金线莲的成分、药理分析，提高对金线莲的利用率;③在对金线莲细胞培养获取药用成分方面还有极大的研究前景。
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