钙离子和锌离子对金针菇菌丝生长的影响

来源:用户上传      作者:陈玉斌 张新伟 顾家屹 王晓林 李佳萌 谢鲲鹏

　　摘要  在培养基中加入不同质量的Ca2+和Zn2+，研究其对金针菇菌丝生长、生物量以及多糖含量的影响。结果表明，固体培养时，Ca2+浓度为1 000～9 000 mg/L促进菌丝的生长，当浓度超过12 000 mg/L时抑制菌丝的生长;Zn2+浓度为10～100 mg/L时促进菌丝的生长，当Zn2+浓度超过150 mg/L时抑制菌丝的生长。液体培养时，Ca2+浓度为5 000 mg/L时，菌丝体多糖含量最多，相比对照组提高139.2%;Zn2+浓度为6 mg/L时，菌丝体多糖含量最大，相比对照组增加141.8%。
　　关键词  钙离子;锌离子;金针菇菌丝
　　中图分类号  S  646.1+5文献标识码  A文章编号  0517-6611（2020）04-0043-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.013
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effects of Calcium Ion and Zinc Ion on the Mycelium Growth of Flammulina velutipes
　　CHEN Yu-bin，ZHANG Xin-wei，  GU Jia-yi  et al
　　（School of Life Science，Liaoning Normal University， Dalian，Liaoning 116081）
　　Abstract  Different quality of Ca2+ and Zn2+ were added to the culture medium to study the effects on the growth morphology， biomass， and polysaccharide content of the mycelium of Flammulina velutipes. The results showed that in the solid culture， when the concentration of Ca2+ was 1 000-9 000 mg/L， the growth of mycelia was promoted. When the concentration was over 12 000 mg/L， the growth of mycelia was inhibited; when the concentration of Zn2+ was 10-100 mg/L， the growth was accelerated. When the concentration of Zn2+exceeded 150 mg/L， the growth of mycelia was inhibited. In the liquid culture， when the concentration of Ca2+ was 5 000 mg/L， the polysaccharide content of mycelia was the highest， which was 139.2% higher than that of the control group. When the concentration of Zn2+ was 60 mg/L， the polysaccharide content of the mycelia was the highest， which was increased by 141.8% compared with the control group.
　　Key words  Calcium ion;Zinc ion;F. velutipes mycelium
　　金針菇（Flammulina velutipes）又称构菌、金菇等，在真菌分类学上隶属担子菌门（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricaceae），伞菌目（Agaricales），小火焰菌属（Flamingo），是一种菌藻地衣类[1]。金针菇含有丰富的营养物质，富含人体必需的各种氨基酸，其中含量较高的是赖氨酸和精氨酸，远高于其他种类的食用菌，有利于对儿童的智力发育 [2-3]。金针菇还可以抗癌、增强人体肌体的免疫能力，是我国著名的功能性营养保健食品[4]。
　　研究表明，钙离子是构成细胞壁不可缺少的重要物质、某些酶的活化剂，可以调节细胞的渗透压[5];锌离子可以维持细胞结构，作为酶的组成部分、酶类的激活剂，能够参与氧化还原反应，促进食用菌菌丝体及子实体的生长，从而提高食用菌的质量及营养价值[6]。目前已成功应用在多种食用菌的栽培上，但关于钙离子和锌离子对金针菇菌丝生长影响的研究尚未见报道。因此，笔者通过研究钙离子和锌离子对金针菇菌丝生长及多糖含量的影响，探寻能减少金针菇菌丝生长周期且不影响菌种质量的金属离子浓度范围，提高金针菇的产量。
　　1  材料与方法
　　1.1  菌种与试剂
　　金针菇菌种，由辽宁师范大学生命科学学院微生物实验室提供。
　　硫酸钙（CaSO4·2H2O）和硫酸锌（ZnSO4·7H2O），均为分析纯产品。
　　1.2  培养基
　　PDA培养基和PDB培养基用途及配方见表1。
　　1.3  试验方法
　　1.3.1  金针菇菌种的制备方法。 　　①固体菌种的制备：无菌操作条件下，将冰箱保存的金针菇菌种接种到PDA平板培养基上，28 ℃恒温培养6～7 d，直到菌丝长满平板即可使用[7]。
　　②液体菌种的制备：无菌操作条件下，将活化后的金针菇菌种挑取1块2 cm2左右的菌丝体接种在装有100 mL PDB培养基中，28 ℃静置培养48 h。然后置于28 ℃、120 r/min的摇床振荡培养6 d，制成液体菌种备用[8]。
　　1.3.2  培养方法。
　　1.3.2.1  PDA固体平板培养。
　　将硫酸钙和硫酸锌各自添加到PDA培养基中，浓度见表2。灭菌后取出，冷却至50 ℃左右时，摇匀培养基后倒平板，待凝固后分别接入直径5 mm的金针菇菌种，每个浓度设置3次重复，共36个平板[9]。每个平板做好标记后置于恒温培养箱下培养5 d，温度设置为28 ℃，记录菌丝体的长势，测量固体培养后金针菇菌落的直径，计算菌丝的生长速率[5，10]。
　　1.3.2.2  PDB液体摇瓶培养。
　　将硫酸钙和硫酸锌各自添加到PDB培养基中，浓度见表2。无添加为对照，每个浓度设置3个重复。250 mL锥形瓶装液100 mL，高压灭菌，设置温度121 ℃、时间20 min，冷却至室温后接入5%的液体菌种，然后置于28 ℃、120 r/min的摇床振荡培养3 d，测定菌丝生物量（菌丝的湿重和干重）[9]。
　　1.4  測定项目与方法
　　1.4.1  金针菇菌丝生长的观察。
　　记录菌丝的生长形态，测量菌落直径，并按照下列公式计算菌丝的生长速率。
　　计算公式：菌丝生长速率=菌落直径/菌丝生长天数[10-12]。
　　1.4.2  金针菇菌丝生物量。
　　取液体培养的培养液，4 000 r/min，离心20 min，取出后水洗，再次离心。收集菌丝体，电子天平称重，重复3次，平均值即为菌丝体的湿重[9]。
　　1.4.3  金针菇菌丝多糖的提取和测定。
　　多糖的提取：将培养液于4 000 r/min离心20 min，常压蒸发上清液，浓缩至20%，浓缩液与95%的乙醇1∶3醇析12 h，继续4 000 r/min离心12 min，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮各洗一次，于60 ℃干燥箱内烘干，得到灰白色多糖[5，8]
　　多糖的测定：采取苯酚-硫酸法，以硫酸、苯酚作为显色剂，它们与金针菇多糖发生显色反应，在490 nm处有最大峰值，测定吸光度，吸收值和多糖含量呈线性关系，通过已获得的葡萄糖标准曲线计算金针菇菌丝体中的多糖含量[6，11]。
　　2  结果与分析
　　2.1  Ca2+对金针菇菌丝生长的影响
　　2.1.1  菌丝生长形态。
　　不同浓度的Ca2+对金针菇菌丝生长形态的影响见图1。由图1可知，金针菇菌种在Ca2+处理下，长势基本良好，菌丝较细密;当Ca2+浓度在2 000～9 000 mg/L时菌落生长茂盛，菌丝细密;当Ca2+浓度为5 000 mg/L时，金针菇菌丝长势较好;当浓度超过12 000 mg/L时抑制菌丝生长。
　　2.1.2  菌丝生物量。
　　不同浓度的Ca2+对金针菇菌丝湿重的影响见图2。由图2可知，当Ca2+浓度为1 000～9 000 mg/L时菌丝体湿重高于对照组，当Ca2+浓度为5 000 mg/L时明显促进金针菇菌丝生长，比对照组的菌丝体湿重增加5.3 g，提高44.2%，当Ca2+浓度为12 000 mg/L明显抑制金针菇菌丝生长。
　　2.1.3  菌丝多糖含量。
　　将添加不同浓度Ca2+的培养液离心，取上清液，加水稀释50倍，在490 nm处测定吸光值，由葡萄糖标准曲线得到相应多糖含量，结果见图3。
　　由图3可知，Ca2+浓度在1 000～9 000 mg/L时，试验组的多糖含量均高于对照组，可见，Ca2+能够促进多糖积累，尤其是在5 000 mg/L时，多糖含量最大，达89.2 mg，比对照组提高139.2%。而Ca2+浓度为12 000 mg/L时，试验组的多糖含量明显少于对照组，说明Ca2+浓度为12 000 mg/L时抑制多糖的积累。
　　2.2  Zn2+对金针菇菌丝生长的影响
　　2.2.1  菌丝生长形态。
　　不同浓度的Zn2+对金针菇菌丝生长形态的影响见图4。由图4可知，当Zn2+浓度在60～100 mg/L时促进金针菇菌丝的生长，当Zn2+浓度为60 mg/L时明显促进金针菇菌丝生长，菌落嫩白，菌丝细密，比对照组的菌丝体湿重增加4.2 g，提高了35%;当Zn2+浓度达150 mg/L时抑制菌丝生长，菌落较小、边缘发黄，生长速率较慢。
　　2.2.2  菌丝生物量。
　　不同浓度的Zn2+对金针菇菌丝湿重的影响见图5。由图5可知，当Zn2+浓度为10～100 mg/L时菌丝体湿重高于对照组，当Zn2+浓度为60 mg/L时明显促进金针菇菌丝生长，比对照组的菌丝体湿重增加4.2 g，提高35%，当Zn2+浓度为150 mg/L明显抑制金针菇菌丝生长。
　　2.2.3  菌丝多糖含量。
　　将添加不同浓度Zn2+的培养液离心，取上清液，加水稀释50倍，在490 nm处测定吸光值，由葡萄糖标准曲线得到相应多糖含量。结果见图6。由图6可知，Zn2+浓度在10～100 mg/L时，试验组的多糖含量均高于对照组，由此可见，Zn2+能够促进多糖积累，尤其是在60 mg/L时，多糖含量最大，达90.1 mg，比对照组提高1418%。而Zn2+浓度为150 mg/L时，试验组的多糖含量明显少于对照组，说明Zn2+浓度为150 mg/L时抑制多糖的积累。 　　3  结论
　　该试验研究Ca2+和Zn2+对金针菇菌丝生长的影响，采用PDA平板和液体摇瓶培养的方法，分别对菌丝生长、生物量和多糖含量等进行研究。结果表明，在PDA固体平板上，Ca2+浓度为5 000 mg/L时明显促进菌丝的生长;在液体摇瓶中Ca2+浓度为1 000～9 000 mg/L时促进金针菇菌丝生长，当
　　Ca2+浓度为5 000 mg/L时明显促进菌丝生长，湿重提高44.2%，多糖含量相比对照组提高139.2%。在PDA固体平板上，Zn2+促进金针菇菌丝生长的浓度为30～100 mg/L，当浓度为60 mg/L时明显促进菌丝的生长，当浓度达150 mg/L时抑制菌丝生长;在液体摇瓶中，当浓度为60 mg/L时明显促进菌丝的生长，菌丝体湿重提高35%，多糖提高了141.8%;当Zn2+浓度超过60 mg/L促进作用均越来越小;当Zn2+浓度达150 mg/L时，上述组别均小于对照组。
　　为了提高金针菇的产量，缩短金针菇生长周期，且不影响金针菇质量，越来越多的人关注将微量元素和金属离子元素应用于金针菇的栽培[5，6，8，9]，该试验结果为金针菇菌丝的栽培提供启示，但需要注意的是，该试验仅限于研究单一金属离子对金针菇菌丝生长的影响，对于2种金属离子复合添加时之间的相互关系并未涉及，在后續的研究中将进一步展开。
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