微生物菌剂对芳樟枝精油主成分芳樟醇的影响

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　　摘要 以芳樟195#一年生扦插苗为研究对象，通过二次正交回旋组合设计试验研究接种固氮菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌对芳樟枝精油主成分的影响。结果表明，试验组芳樟枝精油主成分芳樟醇含量显著提高，樟脑、1，8-桉叶油素含量显著降低;试验组14（固氮菌=40×108 CFU/盆、巨大芽孢杆菌=40×108 CFU/盆、胶冻样芽孢杆菌=60×108 CFU/盆、枯草芽孢杆菌=40×108 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），高出对照组7.80%。
　　关键词 芳樟;芳樟醇;微生物菌剂;二次正交回旋组合设计
　　中图分类号 S725.5  文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）05-0123-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.033
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract Based on annual Cinnamomum camphora （L.） Presl 195 code cuttings，the effects of inoculation of  Azotobacter chroococum，Bacillus magaterium，Bacillus mucilaginosus and Bacillus subtilis on the branch essential oil of C. camphora leaves were studied by quadratic orthogonal rotating combination method.The result showed the test group significantly increased the content of linalool，the main component of C. camphora branch oil，and decreased the content of camphor and 1，8-eucalyptus oil.The principal component of aromatic camphor essential oil in test group 14 （Azotobacter chroococum=40×108 CFU/pot，Bacillus mucilaginosus=40×108 CFU/pot，Bacillus magaterium=60×108 CFU/pot，Bacillus subtilis=40×108 CFU/pot）had the highest content of linalool （87.09%），which was 7.80% higher than that in the control group.
　　Key words Cinnamomum camphora（L.）Presl;Linalool;Microbial agent;Quadratic orthogonal gyrocombination design
　　芳樟[Cinnamomum camphora（L.） Presl]系樟树的一个生化变种，其含有丰富的芳樟醇（C10H18O），故称为芳樟[1]。芳樟除了可作用材和绿化用途外，其主要是用于提炼芳樟油。开发芳樟生物量大、精油含油量高、芳樟醇纯度高、樟脑含量低的种质是发展芳香樟油料林产业化的关键环节。
　　微生物菌是对植物生长发育有益的一类生物菌剂。菌剂中的微生物通过分泌代谢物质可直接或间接影响宿主植物的代谢途径，从而影响宿主的生理特性和生长发育[2]。例如固氮菌（Azotobacter chroococum）可将空气中的气态氮转化成可直接被植物利用的氨态氮[3];胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）有解钾、解磷、固氮等多种作用，并能提高植物产量和品质[4];巨大芽孢杆菌（Bacillus magaterium）是一种植物根系促生细菌，可降解土壤中不能被植物利用的磷和钾[5-6];枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）既能抑制植物病原菌，又能促进植物生长[7-8]。
　　芳樟的精油形成、积累和转化过程非常复杂，受到遗传和环境因素的综合影响[9-11]，通过栽培方式可以影响芳樟的精油合成[12]。目前，鲜有关于微生物菌剂对芳樟枝精油主成分影响的研究報道。笔者拟通过4因素5水平二次回归正交旋转设计，研究固氮菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在不同水平条件下对芳樟枝精油主成分的影响，以确定微生物菌剂最佳方案，为开发与应用这些有益微生物和提升芳樟产业化提供指导。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验地概况
　　试验地位于福建农林大学南门妙峰山苗圃地大棚，试验苗圃所处区域位于118°08′～120°31′E， 25°15′～26°29′N，属亚热带海洋气候，气候温和，雨量充沛。
　　1.2 材料来源
　　盆栽试验采用的材料为来源于福建省永安林业（集团）股份有限公司种苗中心苗圃长势均匀的芳樟195#一年生扦插苗，平均苗高为21 cm。单一成分微生物菌剂固氮菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌来源于沧州旺发生物技术研究所。
　　1.3 试验设计
　　芳樟盆栽试验采用4因素5水平二次回归正交旋转试验设计（表1）， 试验组23个措施组合处理（T1～T23）和1个空白对照组（表2），每个处理3次重复，每个重复10个盆栽。黄心土和有机质采用0.6%高锰酸钾均匀喷施，后用塑料薄膜覆盖密封曝晒8 d后再用于试验苗栽培和接种。盆钵规格为38.5 cm×30.0 cm×30.0 cm，每盆统一装消毒后的黄心土5.5 kg。 　　1.4 方法
　　1.4.1 接种方法和试验苗管护 。
　　芳樟菌剂接种采用灌根接种法，按照试验设计方案分别用无菌注射器提取和接种（灌根）到对应的芳樟盆栽基质中。试验苗于10月栽植，翌年6月结束，一共8个月。每周浇水和拔草1～2次，保证试验苗的正常生长条件。
　　1.4.2 芳樟精油测定。盆栽试验8个月后，采摘试验组芳樟苗枝条，当天将各个试验组枝条擦净，称其鲜重，并将数据整理保存。将称量后的同个试验组的全部样本枝条进行混合，混合后再将各个试验组的芳樟枝条分别装入分装袋，保存于冰箱用于精油提炼。提取芳樟枝精油采用常压水蒸汽蒸馏法。将剪碎的100 g枝条装进蒸馏瓶中，加200 mL开水，蒸馏90 min后熄火，收集精油，测定枝精油含油量，每个试验组进行3次重复。
　　1.4.3 芳樟精油主成分测定。采用SP-6890型气相色谱仪测定芳樟精油的化学组成，参照万琴等[13]的测定方法。
　　1.5 数据分析方法
　　采用DPS7.05数据统计软件，对试验组的芳樟枝精油主成分芳樟醇进行回归方程的拟合、建立数学模型，并进行显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 微生物菌剂对芳樟精油主成分分析
　　对照组芳樟枝精油主成分芳樟醇为80.79%，试验组平均值为83.43%，比对照组高3.27%;试验组的樟脑含量平均值为0.03%，对照组樟脑含量为0.19%，比试验组高出533.33%;试验组的1，8-桉叶油素含量平均值为0.55%，对照组1，8-桉叶油素含量为0.89%，比试验组高出61.81%。结果表明，试验组大部分芳樟醇含量高于对照组，樟脑含量和1，8-桉叶油素含量低于对照组。
　　2.2 微生物菌剂与芳樟枝精油主成分芳樟醇回归方程的建立及显著性检验
　　对芳樟枝精油主成分芳樟醇进行数学模型分析，首先建立编码方程，然后对编码方程进行求解。由表3可知，在α=0.05显著水平下，通过芳樟枝精油主成分芳樟醇的回归显著性检验得F=8.023 42*，表明微生物菌剂对芳樟枝精油主成分芳樟醇的影响存在显著回归关系，模型成立。
　　在0.05显著水平剔除不显著项后，得到四元二次正交旋转回归方程为：
　　Y=83.730 96+0.766 08X1+1.345 70X2+1.481 53X3-0.988 75X1X2-1.043 75X1X4（1）
　　式中，Y代表枝精油主成分芳樟醇（%）;X1为固氮菌施用量;X2为巨大芽孢杆菌施用量;X3为胶冻样芽孢杆菌施用量;X4为枯草芽孢杆菌施用量。
　　2.3 芳樟枝精油主成分芳樟醇单因子效应分析
　　由图1可知，固氮菌、胶冻样芽孢杆菌与芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量呈直线相关，表明增施固氮菌、胶冻样芽孢杆菌可以提高芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量。巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量呈近似直线相关，增施巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌可提高枝精油主成分芳樟醇含量，当巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌施用量在编码值为1.682时，枝精油主成分芳樟醇含量达到最大值，分别是84.93%和84.16%，但在编码值为1.000～1.682区间，枝精油主成分芳樟醇含量趋于平缓，表明适当增施巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌可以提高芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量。
　　2.4 芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最优值
　　运用Excel软件对各个回归方程进行最优求解，求得的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最优值可达92.95%，与之对应微生物菌剂施用量分别为固氮菌=20×10.8 CFU/盆、巨大芽孢杆菌=60×10.8 CFU/盆、胶冻样芽孢杆菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢杆菌=60×10.8 CFU/盆，试验组14（固氮菌=40×10.8 CFU/盆、巨大芽孢杆菌=40×10.8 CFU/盆、胶冻样芽孢杆菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢杆菌=40×10.8 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），最接近于求得的最优方案的微生物菌剂施用量。
　　3 结论
　　试验组芳樟枝精油主成分芳樟醇平均含量高出对照组3.27%;对照组的芳樟枝精油主成分樟脑平均含量高出试验组533.33%;对照组的芳樟枝精油主成分1，8-桉叶油素平均含量高出试验组61.81%，结果表明不同菌剂组合不仅可以提高芳樟醇含量，而且可以降低樟脑含量和1，8-桉叶油素含量，這与笔者研究芳樟优良无性系叶精油主成分遗传稳定性分析得到樟脑与芳樟醇合成方向相反的结论相同[14]。
　　芳樟是以提取芳樟精油的芳樟醇成分为经营目的，精油中的芳樟醇含量高低直接影响精油的价格高低，所以提升芳樟醇含量、降低樟脑和1，8-桉叶油素含量对芳樟产业发展具有重要意义。在芳樟精油生产过程中，绝大多数基地均是枝条和叶片混合一起蒸馏出精油，所以提高芳樟枝条精油主成分芳樟醇相对含量是提高芳樟精油品质的关键。
　　试验组14（固氮菌=40×10.8 CFU/盆、巨大芽孢杆菌=40×10.8 CFU/盆、胶冻样芽孢杆菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢杆菌=40×10.8 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），最接近于求得的最优方案的微生物菌剂施用量。表明4种微生物菌剂（固氮菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）对芳樟叶精油主成分芳樟醇作用效果较好，为生产芳樟专用菌剂提供了理论指导，对芳樟精油化工提纯节约成本和提高芳樟精油品质具有重要意义。
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