微藻的筛选及分类方法

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　　摘 要：石化能源枯竭和生态环境的恶化迫使人们必须高度重视能源的清洁和可持续性，而微藻具有生长快、易培养、种类繁多、功能各异等优点为国内外学者所青睐，也是生产清洁可持续生物质的最佳选择。微藻的筛选、分类、鉴定是研究其生理生化特征的基础，因此保障筛选、鉴定和分类的准确至关重要。随着科技的发展，人们对于微藻分类鉴定方法的探索仍未终止。该文阐述了近年来用于筛选纯化微藻的方法及其优劣，分析并展望了微藻分类和鉴定的发展方向，旨在为微藻的相关研究提供参考。
　　关键词：微藻;筛选;分类
　　中图分类号 Q939.99 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）05-0026-04
　　Progress in Screening and Classification Methods of Microalgae
　　Li Wentao et al.
　　（Biological Science and Engineering Institute，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China）
　　Abstract： In recent years，the depletion of petrochemical energy and the deterioration of the ecological environment have forced people to attach great importance to the cleanliness and sustainability of energy. However，microalgae have the advantages of fast growth，easy cultivation，various types and different functions，which are favored by scholars at home and abroad，it is also the best choice to produce clean and sustainable biomass. The screening，classification and identification of microalgae are the basis for studying their physiological and biochemical characteristics，so it is essential to ensure the accuracy of screening，identification and classification. With the development of science and technology，the exploration of microalgae classification and identification methods has not stopped ，in this paper，the methods for screening and purifying microalgae and their advantages and disadvantages are reviewed. The research progress of microalgae classification and identification is analyzed and the reference for microalgae research is provided.
　　Key words： Microalgae ;Screening ;Classification
　　18世纪工业革命以来，化石能源的消耗与日俱增，导致生态系统严重恶化、环境污染日趋加剧，研发清洁可再生能源成为当务之急。微藻（microalgae）广泛分布于各类水域中，是一类可以自养的单细胞生物，种类多样、光合作用效率高、生长速度快，是生态系统中的初级生产者，作为生物能源的开发潜力巨大。西方发达国家已经利用微藻生物质生产生物柴油或生物酒精[1，2]，我国程军[3]等利用微藻转化制航油也取得较好效果。除此之外，某些种属的微藻成分具有很高的药用价值，其中典型的微藻多糖具有提高机体免疫力的作用，可抗癌、抗衰老、抗疲劳、抗辐射损伤，已经用于医疗保健[4-6]及制作功能食品[7]。另外，微藻也可作为饲料[8]、饵料和食品添加剂[9]，增强营养。更加有意义的是，微藻可以利用污水中的无机、有机等污染物生长，并通过生物积累、生物吸附、生物转化和生物絮凝等方式减缓污染，实现微藻生长和环境污染治理的耦合，这种方式引起国内外广泛重视[10-12]，成为近年来微藻养殖和污水处理领域的新趋勢。
　　微藻种类繁多，能力各异，实现培养优化和环保应用需要探究其理化特性，首先就必须对微藻进行科学筛选和分类，因此有必要讨论筛选和分类的传统方法与现代方法之间的差异，比较其优劣，以便筛选和分类工作能够快速准确。
　　1 微藻的筛选
　　微藻筛选方法与微生物的筛选方法类似，先采用选择性培养基从基质中进行筛选，然后结合显微镜下微藻的形态及理化性质进行初步判断。随着电子技术发展，仪器设备的不断更新，结合仪器进行筛选的先进方法得以建立，使得筛选工作逐步简化，效率提高。
　　1.1 传统筛选方法 传统筛选方法通常是利用毛细管法、平板法和逐级稀释法[13]，根据微藻的表型结构、鞭毛有无、颜色等指标来分离样品中的微藻。但这些因素易受周围环境条件的影响，而且一些同种类型的微藻也会因自身生长状态的不同而存在差异，另有一些亲缘关系较近的物种差异也较小，如：甲藻门的亚历山大藻属的某些种类，仅细胞壁上少数甲片的结构有差别[14]。此外，传统方法筛选速度慢、周期长，对操作人员的业务素质要求较高，因此这种方法有很大局限性。 　　1.2 仪器设备筛选方法 传统筛选方法效率低、盲目性较大、且操作过程繁琐、费用高，不适于微藻的大批量筛选。为此许多国内外学者开始尝试借助于先进仪器进行微藻筛选。例如，韩炜[15]等利用96孔板转盘系统筛选微藻，筛选效果与传统的筛选方式相比有较好的一致性，且筛选速度快。李青[16]等对产油小球藻（Chlorella zofingensis）进行紫外诱变，经尼罗红染色后结合流式细胞仪，筛选出高含油的小球藻藻株，实现了对特定微藻的筛选，取得显著效果。
　　2 微藻的分类
　　2.1 传统分类方法 传统分类方法依据的是微藻细胞形态、大小、生理等指标特性，但由于不同培养基或不同生长阶段的微藻特征有差异，导致判断标准难以把握，同时这种方法难以正确地揭示一些微藻物种之间的亲缘关系，导致在某些微藻属、种的分类上造成混乱。
　　2.2 分子生物学方法 分子生物学分类技术中，常用以同工酶和蛋白质以及DNA多态性为基础进行分析分类[17]。
　　2.2.1 同工酶和蛋白质分析技术 不同微藻种、属间，其各酶系统中的同工酶酶谱带和某些蛋白质的基因型存在差异，因此，依据不同微藻同工酶和蛋白质作为物种的分类方法也是可行途径[18]，且这2种方法酶带少而明确，工作量小。但是，同工酶和蛋白质的可标记位点有限，提供的信息较少，且化学成分差异较小不稳定;同时它们易受基因和多种内外环境因素的影响，因此，在某些微藻属、种的分类和鉴定时，很难得到准确的结果。
　　2.2.2 DNA多态性分析技术 DNA多态性分析技术是以基因序列为基础，根据基因序列间差异进行比较、分析确定其分类，该技术最为直接有效。而不同微藻之间的差异是因其基因组DNA碱基序列间不同引起的，因此，只要测出微藻基因组序列，比较其差异，就可以进行分类，其结果可靠、准确性高。但是，微藻的基因组DNA较为庞大复杂，且种类繁多，全部测序耗财、耗力、耗时。而目前所采用的主要手段是从基因组中选择有代表性的某些片段作为分类标准，通过分析片段间的差异，以确定物种间的遗传差异，达到准确分类。
　　目前在基因水平的分类研究中，主要以线粒体基因组（mitochondrial DNA）、叶绿体基因组（chloroplast DNA）和核基因组（nDNA）的基因序列及其内部转录间隔区Ⅰ和Ⅱ作为分类依据[14]。例如，许多国外研究者利用mtDNA中的细胞色素c氧化酶基因做藻类分类，通过对细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行系统进化分析，分类效果较好[19-20];但是mtDNA重排率高、突变率低，进化速度慢，鉴别位点有限，在同源性分析上受到一定影响，同时在微藻基因组中的拷贝数低，提取纯化困难，所以在微藻分类中应用有限，一般运用于较高等级的分类，如属间、科间甚至更高。而在藻类cpDNA中，由于序列差异比较大，多数在120～220kb之间，所以研究起来较为方便。实验表明，任何2种植物之间其cp DNA至少有30%的同源性，同源性越高，它们在分类群中亲缘关系就越近[21]。而目前对微藻进行属及以上水平进行分类时，cp DNA中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基（rbcL）基因使用者较多，且分类结果可靠[22-24]。核糖体基因功能同源且古老，既含有保守区又含有可变区，且具有高度重复序列，如：编码核糖体RNA（rDNA）的基因和转录间隔区（ITS），因此可作为微藻分类依据。而在核糖体基因分类研究中18srDNA和ITS使用者较多，因其分子大小适合操作，效果显著，被广泛应用于微藻分类学研究[25-29]。但是，ITS序列在微藻种内高度保守，而在种间差异较大，适宜于不同种间的分类，不适宜于科及以上水平的分类。
　　3 其他分类方法
　　3.1 光谱 微藻色素丰富，种类多样，色素成分和浓度差异导致其光谱信息，如吸收光谱，荧光光谱和拉曼光谱存在一定差异，根据差异可以反推或间接确定微藻的种类，因此结合化学计量学方法，利用红外光谱能够进行微藻的快速鉴定、判别和分类[30]。如Lin[31]等人利用高光谱显微成像系统鉴定形态相似的铜绿微囊藻，然后使用Fisher算法来识别微藻物种，其敏感性和特异性很高，结果证明了这种方法可以快速方便地对微藻进行分类，并且还可以获取样本的数量和空间信息。朱慧云[32]等使用已建立的光谱采集系统可有效地识别4种微藻种，为微藻种的鉴定和分类提供了新的途径。使用Vis/NIR光谱仪和便携式光学探针的方法适用于各种微藻物种，是一种快速、精确、无损的检测方法。
　　3.2 变性梯度凝胶电泳技术 变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）是一种重要的分子多态性技术，在物种鉴定及浮游生物群落多样性研究方面有着广泛的应用[33]，而将DGGE技术运用到微藻鉴定中也有许多研究[34]，通常选择18S rDNA和28S rDNA的片段或其它区间作为特征区域，通过DGGE电泳，从而获得微藻的特征性条带进行微藻分类。通过DGGE技术对藻类的特征区域进行差异性分析，可以达到较好的区分效果，同时根据其条带强弱还能观测出样品中的优势微类。但是，该技术所需设备昂贵，对实验室条件有一定的要求，且操作繁琐，耗时耗力，不适于批量操作。
　　4 展望
　　随着微藻生物应用和微藻功能研究的不断深入，正确筛选鉴定和分类是基础，也是一项严峻的挑戰。对微藻进行筛选时，平板划线法虽然操作繁琐耗时长却是最可靠稳妥的方法，操作也较为简单，目前微藻筛选方面需亟待解决的仍然是筛选方法及周期问题。
　　对微藻分类时，特别是依据形态学特征进行表征时，仅通过普通光学显微镜难以观测其表型结构，而电子显微镜价格昂贵，此外，一些微藻形态、大小和表型结构在不同生长期会发生变化或未表露出来，以至于无法做出准确的判断。目前，对微藻分类多采用传统分类结合分子技术手段进行，在分子生物学中，线粒体基因组（mitochondrial DNA;mtDNA）、叶绿体基因组（chloroplast DNA; cpDNA）和核基因组（nDNA）的基因序列及其转录间隔区3者的方法使用较多，是快速鉴定方法。但是，仅依靠1种判断依据对近缘种属间微藻进行分类时，结果会有一定误差，因此需要选用多个判断标准，多重比较才能得出较准确的结论。选择ITS1-2和叶绿体中rbcL以及18sRDNA特征区域作为判断依据是最经济有效可行的手段，目前最为广泛使用。此外，微藻分类研究中，基因组DNA提取不易，试剂盒昂贵，应寻找更为方便快捷的提取基因组方法，或直接利用PCR方法扩增特征区域，使实验更高效。 　　对微藻鉴定时，通常先将序列比对，然后构建系统发育树，分析确定其在遗传系统中的地位。此外，今后藻类分类学研究不能仅仅局限于寻求新的分子指标，也需要借助当前先进仪器，创新思维并寻求更合适的分类方法，还应该去发现某些藻类特有组分，为藻类分类学研究提供准确依据。
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