造纸法再造烟叶萃取液与浓缩液含水率的测定研究

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　　摘  要：通过对色谱条件和前处理条件的选择优化，建立了造纸法再造烟叶萃取液和浓缩液含水率准确、快速测定的气相色谱法。再造烟叶萃取液或浓缩液样品经乙醇振荡萃取过滤后，采用气相色谱结合热导检测器（TCD）进行含水率的测定。结果表明：方法线性范围为1.00～16.00mg/mL，R2=0.9999，加标回收率在96.7%～101.8%，检出限和定量限分别为0.05mg/mL、0.16mg/mL，萃取液和浓缩液测定的RSD分别为0.1% 、0.4% （n=6）。该方法可消除烟草萃取液和浓缩液中易挥发性成分对含水率测定的影响，是一种简单、快速、准确可靠的方法。
　　关键词：再造烟叶;萃取液;浓缩液;含水率;气相色谱法
　　中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）01-0106-05
　　Quantifying Moisture Content in Liquid Extracts and Concentrated Solutions in Paper-making Reconstituted Tobacco
　　Wang Hua1 et al.
　　（1Technology center of China Tobacco Anhui Industrial Corporation，Hefei 230088，China）
　　Abstract：A rapid and accurate quantitative analysis method of moisture content in liquid extracts and concentrated solutions by GC was established on the basis of the main parameters affecting such as chromatographiccondition and Pretreatment conditions were optimized.The water content in liquid extracts and concentrated solutions samples were extracted with ethanol oscillation，after
　　filtered by 0.45μm organic membrane，then determinations were performed by GC with TCD detector and quantified by internal standard method.The results showed that The linear range of the method was 1.00-16.00mg/mL with R2 of 0.9999，the recovery ranged from 96.7 % to 101.8 %，and the detection limit and the limit of quantification were 0.05mg/mL and 0.16mg/mL ，the liquid extracts and concentrated solutions relative standard deviations（RSDs） were 0.1 % （n=6） and 0.4 % （n=6） ，respectively.This method simple，rapid，accurate，which can eliminates the errors caused by volatile components in liquid extracts and concentrated solutions in the determination of moisture content，andoffered more accurate and reliable results.
　　Key words：Reconstituted tobacco;Liquid extract;Concentrated solution;Moisture content;Gas chromatographic method
　　造紙法再造烟叶萃取液或浓缩液由水和固形物2个部分组成，其含水率指标可间接反映固形物含量的大小。再造烟叶萃取液和浓缩液中的固形物含量是浓缩工序质量控制的核心指标，也是造纸法再造烟叶过程和成品品质控制的关键参数。但目前萃取液或浓缩液中固形物含量的测定方法均存在一些缺陷[1]，根据再造烟叶萃取液和浓缩液的成分组成，要准确测定其中的固形物含量，可通过测定样品含水率来实现。
　　目前，含水率的测定方法主要有热干燥法[2]、烘箱法[3]、蒸馏法[4]、卡尔费休法[5-8]、核磁共振法[9]、近红外光谱法[10]等。然而，上述方法均存在一些缺点。例如：在热干燥法和烘箱法的实际温度下，所失去的是挥发性物质的总量，而不完全是水分;在蒸馏法复杂体系中，水与有机溶剂易发生乳化现象，样品中的水分可能未完全挥发出来，水分有时附着在冷凝管壁上，造成读数误差;卡尔费休法消耗试剂多、操作繁琐;近红外光谱法需要先建模，但建模的难度较大，定标样品的选择、制备，精确的化学分析，基础数据的准确性以及选择计量学方法的合理性，都将直接影响最终的分析结果。气相色谱法（GC）则能够消除挥发性成分对含水率测定结果的影响[11]，具有快速、灵敏、准确等优点，现已广泛用于中药[12]及烟草[13-15]含水率的测定。但目前有关气相色谱测定再造烟叶萃取液和浓缩液含水率的研究尚未见报道。为此，本研究针对上述分析方法的不足，建立了测定再造烟叶萃取液和浓缩液含水率的气相色谱法，为再造烟叶固形物含量的准确测定奠定基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂 超纯水（符合GB/T 6682—2008[16]中一级水的要求）;无水乙醇（液相色谱级/光谱级，美国ACS）;异丙醇（液相色谱级，安徽天地高纯溶剂有限公司）。Agilent 6890气相色谱仪（美国Agilent公司，配备热导检测器）;Milli-Q Element型超纯水仪（美国Millipore公司）;HY-5型回旋式振荡器（常州市金坛区环宇科学仪器厂）;电子天平（METTLE TOLEDO AL204-1C，感量0.0001g）;100mL具塞锥形瓶（天长市天沪分析仪器有限公司）;有机相、水相针式滤器（13mm×0.45μm，美国Millipore公司）;5mL一次性注射器（郑州康佳医疗器械有限公司）。
　　1.2 样品前处理 样品来自安徽中烟再造烟叶科技有限责任公司及其他再造烟叶公司生产的再造烟叶萃取液和浓缩液样品。将再造烟叶萃取液或浓缩液样品充分摇晃均匀，准确称量0.5g到100mL干燥具塞的锥形瓶中，加入50mL含内标（异丙醇12.5mL/L）的乙醇溶液，振荡萃取10min;分析前，应摇动萃取液使水分均匀，使用注射器移取约5mL萃取液，在注射器上装13mm×0.45μm的有机相针式滤器，先放出部分（约3mL）萃取液以冲洗滤膜，然后将后续过滤的萃取液转移至色谱瓶中，上盖密封，进行气相色谱分析。为消除试剂、环境、容器等因素的影响，应进行空白实验，在100mL干燥具塞的锥形瓶中，不加样品，按照上述步骤，得到空白溶液，进行气相色谱分析。
　　1.3 气相色谱分析条件 不锈钢填充色谱柱：Agilent Porapak Q柱[长度1.8m，内径2mm，固定相150～180μm （80～100目）];柱箱温度：170℃，等温;进样量：1μL;进样口温度：250℃;载气：氦气，流速10mL/min;检测器：热导检测器（TCD）;检测器温度：250℃。
　　1.4 定性定量分析方法 采用保留时间定性，内标法标准曲线定量。样品含水率按下式进行计算：
　　[X（%）=ct-cb1000×m0×Vt×100]
　　式中：X—样品含水率，%;ct—由标准工作曲线得到的水分质量浓度，mg/mL;cb—空白试验的水分质量浓度，mg/mL;m0—称取样品质量，g;Vt—萃取剂体积，mL。
　　2 结果与分析
　　2.1 色谱条件的选择
　　2.1.1 升温程序 关于气相色谱法检测烟草及烟草制品中水分含量的相关标准和文献已有报道[13-15]。实验在参考国内外标准和文献报道的基础上，对填充柱分别采用表1中的条件进行验证比较，结果表明，在170℃等温条件下测定，样品中的水、乙醇及异丙醇（内标）的分离效果很好，且7min已出峰完毕，分析时间较短;采用80℃、90℃初始温度进行程序升温时，虽然样品中的3个目标物可以有效分离，但基线不是很平稳，且分析时间相对较长（图1）。故实验采用Porapak Q填充色谱柱170℃等温条件测定。
　　2.1.2 载气流速 实验在参考国内外标准和文献报道[13-15]的基础上，比较170℃等温时分别采用载气流速为10mL/min、15mL/min、30mL/min和35mL/min时的分离效果，结果表明：在不同载气流速条件下，样品中各组分均可有效分离，且基线较平稳，载气流速越大，化合物出峰越快，分析时间越短（图2）。从节约资源角度考虑，实验载气流速选择10mL/min。
　　2.1.3 内标 实验采用乙醇为萃取溶剂，甲醇和异丙醇为内标，在柱箱温度170℃、载气流速为10mL/min条件下，对同一样品连续进样200次测定，水、甲醇、乙醇、异丙醇峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.46%、1.20%、1.29%和1.22%，说明甲醇和异丙醇均比较稳定。考虑到甲醇毒性较大，结合色谱分离效果（图3），实验最终确定以异丙醇作为内标。
　　2.2 萃取条件的选择
　　2.2.1 萃取溶剂 由于水分极性较强，实验考察了强极性溶剂甲醇、乙醇和异丙醇萃取效果，分别称取0.5g浓缩液和萃取液样品，再分别加入50mL的甲醇、乙醇和异丙醇，室温下振荡萃取20min，考察3种溶剂对含水率测定结果的影响，每种溶剂平行测定5次，取结果的平均值进行比较。结果表明，甲醇和乙醇对样品水分萃取的能力较好，异丙醇最差。甲醇与乙醇相比，测定的结果较相近，样品中水分含量的相对偏差均<0.5%（表2）。异丙醇与甲醇、乙醇相比，测定浓缩液含水率的相对偏差均>4%，这可能是由于甲醇和乙醇的极性与水较接近，容易分散浓缩液和萃取液样品，从而使水分萃取更完全。考虑到甲醇溶剂毒性较大，所以实验选择乙醇为萃取溶剂。
　　2.2.2 萃取方式 分别准确称取再造烟叶浓缩液和萃取液样品0.5g，选用甲醇和乙醇为萃取溶剂，采用手摇和振荡2种萃取方式测定含水率，结果表明：甲醇和乙醇做溶剂时，手摇与振荡萃取20min测定结果相近（表3）。从实验方法要求操作规范的角度考虑，最终选择乙醇做溶剂振荡萃取的方式。
　　2.2.3 萃取时间 分别称取0.5g浓缩液和萃取液样品，加入50mL含有12.5mL/L异丙醇（内标）的乙醇溶剂，在室温下振荡萃取，考察萃取时间对含水率测定的影响，每个时间条件下平行测定5次，取结果的平均值。结果表明：萃取时间对含水率结果影响不显著，因此选择振荡萃取10min（图4）。
　　2.2.4 称样量 分别准确称取0.1g、0.3g、0.5g、0.7g再造烟叶浓缩液样品，加入50mL含有12.5mL/L异丙醇（内标）的乙醇溶剂，在室温下振荡萃取20min，每个称样量条件下平行测定5次，取结果的平均值。结果表明：不同的称样量含水率测定结果基本相同，說明称样量对实验结果的影响不明显。为尽量减少称量误差，实验选择0.5g为本方法的称样量（图5）。 　　<C：＼Users＼Administrator＼Desktop＼安徽农学通报201901＼2019-01-44.tif>[图5 称样量对含水率的影响]
　　2.2.5 测试样品溶液稳定性 按照1.2中方法处理样品，室温下密封存放不同时间后进行测定，以考察样品测试溶液的稳定性，结果见图6。由图6可知，萃取液含水率随放置时间延长变化很小，96h内含水率与初始值相对偏差在0.5%以内;而浓缩液在放置24h内，含水率与初始值相对偏差在0.5%以内，放置30h后，含水率开始逐渐降低，浓缩液萃取后放置30h、48h、72h和96h时含水率与初始值的相对偏差分别为1.63%、1.82%、1.98%和2.38%。为减少放置时间对含水率的影响，处理后的样品溶液最好在24h内完成测试。
　　2.3 含水率测定方法评价
　　2.3.1 方法的线性关系、检测限及定量限 分别称取0、50mg、100mg、200mg、400mg、600mg和800mg水，准确加入50mL含内标（异丙醇12.5mL/L）的乙醇溶液，得到不同梯度浓度的标准工作溶液。将配制的系列混合标准溶液按照优化后的条件进行分析，以标准溶液中水分与内标物的峰面积比值（y）对相应的浓度（x，mg/mL）进行线性回归分析，得线性回归方程y=0.3317x+0.1863及其相关系数（R2=0.9999），满足内标法定量要求。方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）：以最低浓度的水分标准溶液，重复进样10次，得到测定值的标准偏差（SD），以3倍SD计算检测限为0.046mg/mL，以10倍SD计算定量限为0.155mg/mL。
　　2.3.2 方法的回收率和重复性 采用上述优化后的条件对同一再造烟叶萃取液和浓缩液样品进行6次平行处理、测定，结果见表4。方法的回收率实验采用样品加标法，同一再造烟叶萃取液、浓缩液样品分别取4份，其中1份不加标样，另外3份分别加入低、中、高3个水平等级的水分标准溶液，按实验方法操作，测得样品、低、中、高4个水平下的含水率。每个水平平行测定5次，取平均值进行加标回收率的计算。结果表明，再造烟叶浓缩液的加标回收率在96.73%～100.83%，RSD<0.5%;再造烟叶萃取液的加标回收率在98.18%～101.79%，RSD<0.1%，说明方法的准确性高，重复性好（表4）。
　　2.4 实际样品测定结果 选择不同的再造烟叶萃取液（C1～C10）、浓缩液（N1～N7）和涂布液（T1～T3）样品，采用本方法测定其含水率，结果如表5所示。由表5可知，不同样品溶液的含水率不同，浓缩液样品含水率一般在40%～65%，萃取液含水率较高，一般在85%以上，无论是萃取液还是浓缩液，使用本方法均可准确测定其含水率。
　　3 结论与讨论
　　本文通过对色谱条件、萃取条件等的优化，建立了再造烟叶萃取液和浓缩液含水率的气相色谱法。采用本方法，6次测定萃取液和浓缩液的变异系数分别为0.09%和0.39%，加标回收率在96.73%～101.79%，检出限为0.046mg/mL，定量限为0.155mg/mL。该方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好的特点，适合大批量样品的快速测定。另外，本方法可消除烟草萃取液和浓缩液中易挥发性成分对含水率测定的影响，测定结果更准确、可靠。
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