5种中草药及复配液的抑菌性研究

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　　摘要 挑选了黄连、柴胡、甘草、板蓝根、黄芪这5种中草药，采用水提法制备单剂中草药的提取液，并按照排列组合法，将5种提取液按照相同比例进行混合，得到不同配方的复配液，共计31种。枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试菌，采用牛津杯法对3种供试菌进行体外抑菌，经对比分析后发现，ML 6（柴胡、甘草、板蓝根）对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直径最大为24.6 mm，ML 3（黄连、柴胡、黄芪）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力均较强，抑菌圈直径分别为22.5和20.8 mm。
　　关键词 致病菌，中草药，复配液，抑菌性
　　中图分类号 R285文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）06-0156-03
　　Abstract Five kinds of Chinese herbal medicine were selected to do experiments，such as Chinese goldthread，radix bupleuri，liquorice，isatis，astragalus membranaceus.The extracts of Chinese herbal medicine were prepared by water formulation，and five kinds of extracts were mixed according to the same proportion to obtain a total of 31 different compounds.Bacillus subtilis，Escherichia coli and Staphylococcus aureus were choosed for the test bacteria，the Oxford Cup method was used to inhibit bacteria in vitro of three kinds of test bacteria，after analyzing the average of three groups data in the parallel experiments，we found that ML 6 （radix bupleuri，liquorice，isatis） had the best bacteriostatic effect on Bacillus subtilis，and the diameter of the fungus ring was 24.6 mm at the maximum，ML 3 （Chinese goldthread，radix bupleuri，astragalus membranaceus） had strong antibacterial activity against E.coli and Staphylococcus aureus，and the diameter of the fungus ring was 22.5 and 20.8 mm，respectively.
　　Key words Pathogen， Chinese herbal， Compound solution，Antimicrobial
　　抗生素的滥用致使许多细菌和病毒突变，出现了耐药性的细菌和病毒，所以从天然药物中筛选毒副作用小的高效抑菌中草药及其有效成分的复配物刻不容緩[1]。中草药的组成主要包含植物类药（根、茎、叶、果）、动物类药（脏腑、皮、骨或器官等）以及矿物类药[2]。因为植物药成分在中医药材中所占比例较大，所以中药也称中草药。目前，全国各地使用的中药大约在5 000种左右，再将各种药材按照不同比例、在不同条件下相配而形成的复方药剂更是多不胜数。中草药在我国有上千年研究历史，并在今天形成了一门独立的学科——本草学。
　　据报道，很多草药都有抗菌和抗病毒的作用，但作用机理不同于西药，其中原理也较为复杂。中草药可以调节机体的免疫功能[2]，可以抗氧化、清除自由基[3-4]，有的中草药具有直接的抗菌、抗病毒作用[5-6]，已有试验证实上百种中草药都具有抗菌或抗病毒的作用，且大多数是清热类药物，但相比于抗菌素等西药其直接抗菌作用不如西药好，同时有很多试验还表明，复方中药的抗菌作用比单味药物的抗菌作用强。笔者选用黄连、柴胡、甘草、板蓝根、黄芪5种草药，研究其在体外的抑菌能力。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　黄连、柴胡、甘草、板蓝根、黄芪，均购于济南同仁堂，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，均为齐鲁理工学院微生物学实验室保藏菌种。培养基：LB培养基。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 中草药水提取液的制备。
　　将黄连、柴胡、甘草、板蓝根、黄芪这5种中草药除去碎石块、砂砾等可见杂质，并放入烘箱中30 min进行烘干[7]。分别称取已烘干的单味中草药25 g，按料液比为1∶10的比例用蒸馏水充分浸泡2 h，混合后，用传统煎煮法，强火加热至煮沸后再以文火慢煎1 h，再用纱布和滤纸进行过滤，收集滤液，置于冰箱中4 ℃保存，收集滤渣，按料液比为1∶5的比例加入蒸馏水125 mL浸泡2 h，再按照上述方法煎煮约1 h，收集滤液，合并2次滤液蒸发至25 mL，使每毫升药液中含有1 g原药，制成所需的5种单味煎剂[8-9]。将5种单味煎剂按照数学上排列组合的方法，将单味煎剂按相同比例进行两两混合、三三混合、四四混合和5种混合，得到26种混合样液（表1）和5种单味样液，置于冰箱中4 ℃保存。
　　1.2.2 中草药复方制剂的抑菌试验。 　　采用牛津杯法：吸取供试菌悬液0.1 mL，涂布于LB培养基表面，在培养基表面上等距离放置无菌的牛津杯，吸取200 μL待测复方制剂打入牛津杯中。37 ℃恒温培养箱中培养16～24 h后，测定抑菌直径R。以氨苄青霉素（50 μg/mL）、无菌水为对照。抑菌圈直径R<10 mm 抑菌能力较弱，10～14 mm 抑菌能力一般，15～20 mm 抑菌能力较好，>20 mm 抑菌能力突出[10]。
　　2 结果与分析
　　2.1 单剂中草药对供试菌的抑菌作用研究
　　从5种中草药单剂提取液以及对照组的抑菌效果（图1）可以看出，不同种中草药提取液在对不同菌样的抑制能力上表现出了很大的差异。相对于中草药提取液而言，氨苄青霉素对3种菌样的综合抑菌效果较为强烈，5种单剂中草药提取液都对枯草芽孢杆菌的抑制作用较为强烈，对大肠杆菌的抑制作用较弱。
　　2.2 复配液对供试菌的抑菌作用研究 5种中草药提取液两两复配得到的复配液的抑菌效果见图2。从图2可以看出，经复配后的大部分提取液其抑菌能力均有不同程度的提升，MQ 1（黄连、柴胡）对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制能力较强，但在10种复配液中对金黄色葡萄球菌的抑制能力排名最后，MQ 2（黄连、甘草）对3种菌的抑制能力较为平均且效果为中上，其抑菌圈直径在17.0～17.5 mm，在10种复配液中对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强，MQ 3（黄连、板藍根）对3种菌的抑制能力较高，在10种复配液中对大肠杆菌的抑制能力最强，MQ 4（黄连、黄芪）为黄芪和黄连复配液，2种药剂在单独使用时抑菌效果较为明显，但混合后抑菌能力却有了大幅度的下降，MQ 5（柴胡、甘草）为柴胡和甘草复配液，二者混合后在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力上有了较大幅度提升，但对枯草芽孢杆菌有了大幅度的下降，MQ 6（柴胡、板蓝根）复配液在10种复配液中对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强，MQ 7（柴胡、黄芪）、MQ 8（甘草、板蓝根）、MQ 9（甘草、黄芪）对3种菌的抑制效果较为一般，MQ 10（板蓝根、黄芪）对枯草芽孢杆菌的抑制能力仅次于MQ 6，排名第二。综上所述，中草药提取液经复配后在对3种供试菌抑菌圈直径的上限和下限上均有提升，且有部分复配液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力超过了抗生素氨苄青霉素。对大肠杆菌抑制能力从强到弱依次为MQ 3>MQ 1>MQ 9>MQ 6>MQ 2、MQ 4>MQ 5>MQ 7>MQ 8 >MQ 10，对枯草芽孢杆菌抑制能力从强到弱依次为MQ 6>MQ 10>MQ 1>MQ 3、MQ 8>MQ 5>MQ 9>MQ 2>MQ 7>MQ 4，对金黄色葡萄球菌抑制能力从强到弱依次为MQ 2>MQ 3>MQ 8>MQ 10>MQ 4、MQ 7>MQ 9>MQ 5>MQ 6>MQ 1。
　　5种中草药提取液三三复配得到的复配液对3种菌的抑菌效果见图3。从图3可以直观地看出，与两两混合复配液相比，三三混合复配液的抑菌能力在整体上有了极大的提高，特别是枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均值大于>20 mm。其中ML 3（黄连、柴胡和黄芪）复配液在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力在10种复配液中位居第一，活性最高，ML 4（黄连、甘草和板蓝根）复配液对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强，对金黄色萄球菌和大肠杆菌的抑制能力也较好，ML 7（柴胡、甘草和黄芪）复配液对大肠杆菌的抑菌能力最弱，且达到了目前为止所有复配液的最低值，ML 8（柴胡、板蓝根、黄芪）对枯草芽孢杆菌的抑菌能力最弱，并且在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力上也并不突出，ML 10（甘草、板蓝根、黄芪）对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最弱，但对枯草芽孢杆菌的抑菌能力较好。综上所述，三三复配液在整体抑菌能力上的确优于两两复配液，不论是抑菌圈直径的平均值还是上下限都有了一定程度的提高。
　　5种中草药提取液四四复配与5种混合复配液抑菌效果见图4。从图中可以看出，枯草芽孢杆菌依旧对复配液较为敏感，但与两两复配液和三三复配液相比没有较大的提升。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力也并不理想。其中AS 4（黄连、甘草、板蓝根、黄芪）对枯草芽孢杆菌的抑制能力在所有药液中最强，AS 2（黄连、柴胡、甘草、黄芪）和AS 3（黄连、柴胡、板蓝根、黄芪）在这6组复配液中的综合抑菌效果较好，但仍低于前面两两复配液和三三复配液效果，FS为5种草药的混合药液，但在对3种供试菌的抑制能力并没有特别出色甚至低于单剂药液的抑菌能力。
　　综合以上所有结果表明，中草药中的各种成分与其他中草药复合后，可能既存在着相互增益的作用，又存在着拮抗作用，并不是所有效果好的单剂草药经复合后其抑菌效果都能得到增强，在实际中还需要根据具体病原菌的特性，研制药剂，并多次进行平行试验，确定其抑菌能力。
　　3 结论
　　通过查阅资料和文献初步筛选出抑菌能力较好的5种中草药：黄连、柴胡、甘草、板蓝根、黄芪，对上述中草药进行煎煮，得到每1 mL中含有1 g原药的单剂提取液，再按照比例配成两两复配液（1∶1）、三三复配液（1∶1∶1）、四四复配液（1∶1∶1∶1）和5种等比混合液，并测试其体外抑菌效果。试验过程中加入了无菌水作为阴性对照且排除了其对试验的干扰，还加入了抗生素氨苄青霉素作为阳性对照，经3组平行试验后得到试验数据，对其进行对比分析，结果表明，复配液ML 3（黄连、柴胡、黄芪）、复配液ML 4（黄连、甘草、黄芪）的综合抑菌效果最好，其中ML 3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用在所有复配液中最强，ML 4次之，复配液MQ 4（黄连、黄芪）、MQ 1（黄连、柴胡）、AS 4（黄连、甘草、板蓝根、黄芪）分别对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力在所有复配液中最弱。 　　从上述2个现象中发现，以上5种复配液中均有黄连出现，黄连与柴胡和黄芪一同混合时抑菌效果最强，但与黄芪和柴胡单独混合时抑菌能力却大幅度下降，原因可能是黄连中的某种成分可能与黄芪和柴胡中的药物成分有拮抗作用，使得MQ 1对金黄色葡萄球菌的抑制能力减弱，但对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的效果依旧强劲，而黄连和黄芪单独使用时，其生物活性都很高，对3种菌的抑制能力都较强，推测2种不同的抑菌机制在混合后产生拮抗，致使有效成分的抑菌能力减弱。ML 4中加入了板蓝根后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果也大大减弱，可能也是由于其某成分與其他3种提取液有拮抗作用。总的来说，在所有复配类型中，三三混合的效果最突出，优于其他混合和单剂提取液，根据三三混合方法有利用提升抑菌效果。
　　参考文献
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