过量锰处理对柱花草次级代谢物、酶活性和SgPALs基因表达的影响

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　　摘  要：以熱研二号（RY2）柱花草为材料，分析过量锰处理（100～600 ?mol/L）对柱花草生长、次级代谢物、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPALs基因表达的影响，探讨金属锰毒害对柱花草次级代谢途径的影响。结果表明：相对对照锰（5 ?mol/L）处理，400、600 ?mol/L锰处理显著抑制柱花草叶片叶绿素浓度、最大光化合速率（Fv/Fm）、地上部和根部生物量。随着外源锰处理浓度（100～600 ?mol/L）的增加，叶片原花青素、总酚和单宁含量呈现出逐渐增加的趋势，而叶片类黄酮含量逐渐降低。此外，400、600 ?mol/L锰处理显著增加叶片PAL酶活性，但对PPO活性影响不明显。定量PCR结果表明，过量锰处理对SgPAL1和SgPAL2基因表达影响不明显，但过量锰处理增强了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草叶片中的表达。以上结果说明，柱花草可能通过苯丙氨酸途径调控次级代谢响应金属锰毒胁迫，且SgPAL3和SgPAL4基因可能参与该响应过程。研究结果为探索柱花草响应金属锰毒胁迫机理提供重要依据。
　　关键词：柱花草;锰毒害;次级代谢;苯丙氨酸解氨酶
　　中图分类号：Q945.78      文献标识码：A
　　Effects of Excess Manganese on Secondary Metabolites， Enzyme Activity and SgPALs Gene Expression in Stylosanthes
　　JIA Yidan1， HAN Jiarui1， LI Jifu1， WANG Guihua3， LIU Pandao2， LIU Guodao2， LUO Lijuan1*， CHEN Zhijian1，2*
　　1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
　　Abstract： In this study， the effects of different manganese （Mn） levels on the growth， chlorophyll content， secondary metabolites and activities of polyphenol oxidase （PPO） and phenylalnine ammonialyase （PAL） as well as SgPALs expressions were investigated using Stylosanthes （stylo） genotype RY2. Results showed that the chlorophyll concentration， maximum photochemical rate （Fv/Fm）， shoot and root dry weight of stylo significantly decreased by 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments. The contents of proanthocyanidin， total phenol and tannin increased but the flavonoid content decreased in the leaves ranged from 100 ?mol/L to 600 ?mol/L. Furthermore， the activities of PAL， except PPO， increased under 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments compared to that in the 5 ?mol/L Mn treatment. qRT-PCR analysis showed that the expressions of SgPAL3 and SgPAL4 in the leaves were significantly enhanced by excess Mn treatments， in despite of the expressions of SgPAL1 and SgPAL2 were not regulated by Mn. The results suggested that the regulation of the secondary metabolites through SgPALs mediated phenylalanine pathway might be involved in the response to Mn toxicity in stylo. The study would provide an important basis for exploring the mechanisms of stylo in response to Mn toxicity. 　　Keywords： Stylosanthes; Mn toxicity; secondary metabolism; phenylalnine ammonialyase
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.013
　　锰是植物生长发育所必需的微量元素之一，在植物生命活动过程中起重要作用。锰与光合作用密切相关，能够维持叶绿体膜的正常结构，参与光合电子传递系统的氧化还原和光系统Ⅱ中水的光解过程[1-2]。锰也是超氧化物歧化酶（SOD）的组成成分，可催化超氧化自由基转变为过氧化氢和氧气，从而防止膜脂过氧化[3]。一般认为，20～40 mg/kg植株锰浓度足以满足植物生长发育所需，当低于这个锰浓度范围时，叶绿素合成、酶活性以及光合作用会受到抑制，叶片出现变黄失绿的缺锰性状，最终降低植株的生物量[1，4]。另一方面，锰是地壳中第2丰富的过渡金属元素，也被认为是重金属元素之一，其广泛分布于土壤、沉积物和生物材料中。在地壳中，锰的平均含量为1000 mg/kg。在我国可耕作土壤中，锰的平均含量可达574 mg/kg[5-6]。当植株体内的锰浓度超过150 mg/kg时，叶片会出现褐色锰氧化斑点、厚度减小、卷缩乃至植株萎蔫坏死等锰毒害现象，导致作物减产[1， 7-8]。
　　过量锰毒害会对植物造成产生一系列的应激反应，如产生过氧化胁迫、改变酶活性、抑制光合作用、影响植株对其他营养元素（如磷、钙、镁和铁等）的吸收、转运和分配[9]。例如，在过量锰处理下，波兰小麦（Triticum polonioum）叶片会出现黄化和坏死斑点，叶绿素含量降低[10]。随着外源锰浓度的增加，油菜幼苗叶片过氧化氢酶（CAT）活性显著降低，而过氧化物酶（POD）活性则表现出增加的趋势[11]。研究表明，过量锰会导致豇豆（Vigna unguiculata）叶片形成肉眼可见的褐色斑点，进一步研究发现，其褐色斑点主要由氧化态锰和酚类物质组成[12]。另外，在过量锰胁迫下，豇豆叶片愈创木酚POD和NADH-POD酶活性以及酚类物质含量的变化，被认为是豇豆对锰毒胁迫的应激响应[12]。植物在长期进化过程中，形成一系列适应锰毒害的机制。例如，在过量锰胁迫下，植物可通过根系分泌有机酸或其他化合物螯合锰离子，减少锰的吸收缓解锰毒胁迫。另外，进入植物细胞中的过量锰，可被转运至液泡和细胞壁等非活性部位。并且，通过增强抗氧化系统，可降低金属锰对植物的毒害[13]。此外，在锰毒胁迫中，植物可以通过调控次级代谢途径（如苯丙烷类代谢）及其相关蛋白（如苯丙氨酸解氨酶）表达应对锰毒胁迫[14]。
　　柱花草（Stylosanthes spp.）是豆科蝶形花亞科的1个属。柱花草不仅可作为饲料牧草喂养牲畜，且可作为豆科绿肥覆盖果园、改良以及修复土壤，具有重要的经济价值和生态效益[15]。相对苜蓿（Medicago sativa）、豇豆和菜豆（Phaseolus vulgaris）等豆科植物，柱花草具有忍耐锰毒害的优良特性，是探索植物响应金属锰毒胁迫机理的良好研究材料[13， 16-17]。叶片失绿、最大光化合效率（Fv/Fm）和植株生物量降低被认为是柱花草主要的锰毒害症状[13-14， 17-18]。虽然锰毒害对柱花草生长和柱花草适应锰毒胁迫机理已有文献报道，但锰毒害对柱花草次级代谢物及其相关酶活性和基因表达的影响仍不清楚。因此，本研究以热研二号（RY2）柱花草为材料，分析不同锰浓度处理对柱花草生长、4种次级代谢产物、多酚氧化酶（PPO）、如苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPAL1-4基因表达的影响，以期为探究锰毒害对柱花草次级代谢途径的影响提供理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　所用供试材料为热研二号（RY2）柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草种子由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草研究室提供。
　　1.2  方法
　　1.2.1  处理方法  参考刘攀道等[19]方法，将柱花草种子去种皮并于80 ℃加热2 min后，将种子置于在黑暗条件下萌发2～3 d。将萌发后的柱花草幼苗移至1/2 Hoagland营养液中，在温室内进行培养。幼苗正常培养1个月后，进行4个锰浓度处理，分别为5、200、400、600 ?mol/L MnSO4。用KOH或H2SO4调pH至5.0。每个处理设置4个重复，处理10 d后，分别收获地上部和根部样品。一部分样品用于干重测定，另一部分样品用液氮速冻后，于?80 ℃保存备用。
　　1.2.2  叶绿素含量测定  称取0.1 g叶片，放入10 mL 80% 丙酮中避光提取过夜。于分光光度计中分别测定663、645 nm处吸光度，计算叶绿素含量，采用鲜重。
　　1.2.3  锰含量的测定  柱花草样品于105 ℃下杀青30 min，75 ℃烘干至恒重后，称取0.07 g样品于灰化瓶中，加入适量浓硫酸乙醇（5∶95）混合液浸湿样品，于马弗炉中600 ℃灰化10 h。待样品冷却后，加入8 mL 100 mmol/L HCl充分溶解样品。采用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP- AES）测定样品中的锰含量。
　　1.2.4  柱花草次级代谢含量的测定  总酚提取与测定：称取约0.1 g烘干后的叶片，加入2.5 mL试剂盒（南京建成生物工程研究所，下同）中的提取液，并充分研磨样品，于60 ℃提取30 min。12 000 r/min，25 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书加入反应液，于分光光度计中测定760 nm处吸光度，并计算总酚含量，采用干重。
　　类黄酮提取与测定：称取约0.02 g烘干后的叶片，加入2 mL提取液并充分研磨样品，于60 ℃提取2 h。12 000 r/min，25 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书加入反应液，于分光光度计中测定502 nm处吸光度，并计算类黄酮含量，采用干重。 　　原花青素提取与测定：称取约0.1 g烘干后的叶片，加入2 mL提取液并充分研磨样品。30 min，10 000 r/min，25 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书加入反应液，于分光光度计中测定500 nm处吸光度，并计算原花青素含量，采用干重。
　　单宁提取与测定：称取约0.1 g新鲜叶片，加入1 mL蒸馏水，充分研磨匀浆后转移到1.5 mL离心管中，于80 ℃水浴提取30 min，8000 g，25 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书加入反应液，于分光光度计中测定760 nm处吸光度，并计算单宁含量，采用鲜重。
　　1.2.5  苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性测定  PAL提取与测定：称取约0.1 g叶片样品，加入0.9 mL 提取液，在冰上并充分研磨样品。10 000 g，4 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所）加入反应液，于分光光度计中测定290 nm处吸光度，并计算PAL酶活性。
　　PPO提取与测定：称取约0.1 g叶片样品，加入1 ml提取液，在冰上并充分研磨样品。8000 g，4 ℃离心10 min，取上清。参考试剂盒说明书加入反应液，于分光光度计中测定410 nm处吸光度，并计算PPO酶活性。
　　1.2.6  柱花草叶片总RNA提取、cDNA合成和实时荧光定量PCR  参照 TRIzol（Invitrogen inc，美国）方法提取柱花草叶片总RNA。参照M-MLV反转录试剂盒（Invitrogen inc，美国）方法合成cDNA第一链。实时荧光定量PCR参照ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix定量试剂盒说明书方法进行，用Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex运行QuantStudioTM Real-Time PCR Software及计算分析每个样品的表达量。基因表达分析包括3个生物学重复。相对表达量为目的基因的表达量与看家基因（SgEF-1α）表达量的比值。实时荧光定量PCR引物如表 1 所示。
　　1.3  数据处理
　　采用Excel 2003软件进行数据分析，用SPS S 20.0（SPSS Institute，美国）软件进行单因素方差分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  不同锰浓度处理对柱花草生长的影响
　　叶片失绿、最大光化学效率（Fv/Fm）和植株生物量降低是柱花草主要的錳毒害症状。如图1所示，过量锰处理显著抑制柱花草的生长。随着外源锰浓度的增加，叶片叶绿素含量和Fv/Fm逐渐降低，在600 ?mol/L锰处理下叶绿素含量和Fv/Fm达到最低值。与对照（5 ?mol/L）锰处理相比，柱花草在400、600 ?mol/L锰处理下的叶绿素浓度分别降低37.9%和38.0%，Fv/Fm分别降低22.2%和27.8%，差异显著（图1A、图1B）。
　　类似的，过量锰处理（400、600 ?mol/L）显著降低柱花草地上部和根部生物量。与对照（5 ?mol/L）锰处理相比，在400、600 ?mol/L锰处理下，柱花草地上部干重分别降低26.5%和32.4%，而根部干重分别显著降低17.4%和21.7%（图1C、图1D）。
　　2.2  不同锰浓度处理对柱花草组织锰含量的影响
　　从图2可以看出，过量锰处理显著增加了柱花草地上部和根部的锰含量。与对照（5 ?mol/L）处理相比，400～600 ?mol/L锰含量处理的柱花草地上部锰含量增加2.8～4.1倍，根部锰含量增加1.5～ 1.8倍（图2）。此外，根部积累的锰含量显著高于地上部锰含量。在400、600 ?mol/L锰处理下，根部锰含量分别是地上部锰含量1.9和1.6倍（图2）。
　　2.3  不同锰浓度处理对柱花草叶片次级代谢物的影响
　　进一步分析不同锰浓度处理对柱花草叶片4种次级代谢物（原花青素、总酚、类黄酮和单宁）浓度的影响。从图3可看出，随着外源锰处理浓度的增加，叶片原花青素、总酚和单宁浓度呈现出逐渐增加的趋势，而类黄酮浓度则逐渐降低。与对照（5 ?mol/L）处理相比，600 ?mol/L锰处理的柱花草叶片原花青素、总酚和单宁浓度分别增加85.9%、47.2%和27.4%（图3A、图3C、图3D），而类黄酮浓度则降低27.1%（图3B），差异显著。
　　2.4  不同锰浓度处理对柱花草苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性的影响
　　从图4可看出，不同锰浓度处理对柱花草叶片PAL和PPO活性的影响不一样，过量锰处理（400、600 ?mol/L）显著增加叶片PAL酶活性，但对PPO活性影响不明显。与对照（5 ?mol/L）处理相比，400、600 ?mol/L锰处理的柱花草叶片PAL酶活性分别增加13.3%和60.2%（图4）。
　　2.5  不同锰浓度处理对SgPALs基因表达的影响
　　本研究进一步分析了不同锰浓度处理对Sg PAL1-4基因表达的影响。从图5可以看出，不同锰浓度处理对SgPALs基因表达的影响不一样，与
　　基因表达分析包含3个生物学重复。不同小写字母表示锰处理间差异显著（P<0.05）。
　　对照（5 ?mol/L）相比，过量锰处理对SgPAL1基因表达影响不明显，而200 ?mol/L过量锰处理显著抑制了Sg P AL2基因的表达（图5A，图5B）。另外，200、400 ?mol/L锰处理分别增强了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草叶片中的表达。在200 ?mol/L锰处理下，Sg P AL3基因的表达量是对照（5 ?mol/L）处理下的6.89倍，而在400 ?mol/L锰处理下，SgPAL4基因的表达量是对照（5 ?mol/L）处理下的1.88倍（图5C、图5D），差异显著。 　　3  讨论
　　锰是植物生长所必需的营养元素之一，但锰也是重金属元素，植物细胞内过量积累的锰离子会对植物造成毒害，导致作物减产[20]。研究表明，在较低的锰浓度（50 ?mol/L）处理下，其可导致豇豆、大麦（Hordeum vulgare）和大豆（Glycine max）叶片形成锰氧化斑的毒害症状[12， 21-22]。在本研究中，虽然200 ?mol/L錳处理降低柱花草叶绿素含量和Fv/Fm，但对柱花草地上部干重并没有显著影响，而只有400和600 ?mol/L锰浓度处理才显著降低柱花草叶绿素浓度、Fv/Fm、地上部和根部生物量（图1）。这与已有研究结果类似，柱花草在低于200 ?mol/L锰处理下并没有明显的锰毒害症状，只有在400 ?mol/L锰浓度处理下才显著降低了柱花草叶绿素含量和植株干重[18]。本研究结果进一步表明柱花草具有较强的耐锰毒能力。在过量锰处理下，虽然柱花草根部的锰含量和地上部锰含量均逐渐增加，但根部的锰含量显著高于地上部（图2）。根部积累锰，减少锰向地上部运输被报认为是柱花草适应锰毒害的机制之一[18]。
　　次级代谢物，如原花青素、总酚、单宁和类黄酮等酚类物质，是植物应对逆境胁迫的关键化合物。这些酚类化合物与植物戊糖磷酸酯、莽草酸和苯丙酸代谢途径密切相关[23-24]。酚类化合物能够清除自由基、螯合金属阳离子，从而参与植物应对逆境胁迫[25]。研究发现，重金属胁迫会影响植物次级代谢途径，改变次级代谢物含量。例如，在过量锰胁迫下，豇豆叶片酚类物质和胼胝质含量、水稻叶片木质素和黄酮类化合物以及杨树（Populus cathayana）叶片中苯丙氨酸的含量均有所增加，进而响应金属锰胁迫[26-27]。此外，金属镉胁处理也增加秋茄（Kandelia candel）幼苗叶片中的单宁和总酚含量[28]。桐花树（Aegiceras corniculatum）根和叶中的单宁能与一些金属离子（如铁、镉等）络合形成难溶性化合物，从而缓解重金属毒性[29]。因此，调控次级代谢物含量可能是植物响应重金属胁迫的适应性变化之一[30]。本研究发现，随着外源锰浓度的增加，柱花草叶片原花青素、总酚和单宁含量呈现出逐渐增加的趋势，而叶片类黄酮含量逐渐降低（图3）。以上结果暗示，在过量锰胁迫下，柱花草可能通过调控次级代谢物含量从而响应锰毒害。
　　进一步对PPO和PAL酶活性进行分析，结果表明，400、600 ?mol/L过量锰处理显著增加柱花草叶片PAL酶活性，但对PPO活性影响不明显（图4）。且定量PCR结果表明，在4个SgPALs基因中，200、400 ?mol/L锰处理分别增强了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草叶片中的表达（图5）。PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、调控苯丙烷类合成代谢途径的关键酶和限速酶[29]。研究发现，重金属处理调控了PAL基因和蛋白表达以及酶活性。例如，在大豆和羽扇豆（Lupinus luteus）中，金属铅处理显著增加了根系PAL酶活性以及PAL基因表达[31]。在山苔草（Carex putuoshan）中，金属铅和锌处理提高了PAL蛋白表达量[32]。最近，通过蛋白质组学研究方法，发现锰毒害处理增强了PAL蛋白在柱花草根系中的表达[14]。因此，在本研究中，SgPAL3和SgPAL4基因可能参与了柱花草响应锰毒害的过程。另一方面，PAL参与的苯丙烷类代谢途径可生成反式肉桂酸等中间产物，这些中间产物可进一步转化为香豆素、绿原酸等，再通过多条途径进一步转化成类黄酮、木质素、生物碱、原花青素等级次代谢产物，这些次级代谢物在植物响应逆境胁迫中起重要作用[33-35]。因此，在本研究中，柱花草可能通过提高PAL酶活性以及增强SgPAL3和SgPAL4基因表达，从而通过苯丙氨酸途径调控了次级代谢物含量，进而响应金属锰毒胁迫。然而，SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草响应锰毒害过程中的生物学功能有待进一步研究。
　　综上所述，过量锰胁迫增加柱花草叶片原花青素、总酚和单宁含量，而降低类黄酮。柱花草可能通过提高PAL酶活性以及增强SgPAL3和SgPAL4基因表达，从而调控次级代谢物的含量，进而通过苯丙氨酸途径调控次级代谢响应金属锰毒胁迫。本研究结果为探索柱花草响应金属锰毒害机理及提供重要的理论依据。
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