Bacillus siamensis和Bacillus subtilis中2个β-D-葡萄糖苷酶编码基因克隆、表达及酶学研究

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　　摘  要：采用RACE技术扩增2株Bacillus属菌株XY18、XY20的β-D-葡萄糖苷酶编码基因bgl全长，构建重组载体pET28a（+）/bgl、pET28b（+）/bgl，导入E. coli BL21诱导表达，采用Ni亲和层析纯化蛋白。经酶学性质测定发现：2个蛋白均为弱酸性蛋白，温度为40 ℃时酶活力达到最大，具有一定耐热性。以上结果表明，为优化2株Bacillus属菌株参与香草兰发酵工艺，可提供适当弱酸性条件、适宜温度。
　　关键词：Bacillus;β-D-葡萄糖苷酶;基因克隆
　　中图分类号：Q939.124    文献标识码：A
　　Abstract： The full length of bgl of Bacillus sp. XY18 and Bacillus sp. XY20 was amplified by RACE. The recombinant vectors pET28a （+）/bgl and pET28b （+）/bgl were constructed， then transferred into E. coli BL21 for induction expression， and the protein was purified by Ni affinity chromatography. The enzymatic properties of the two proteins were determined. The two proteins were weak acidic proteins， and the enzyme activity reached the maximum at 40 ℃ with certain heat resistance， suggesting that appropriate weak acid condition and temperature could be provided to optimize the vanilla curing process.
　　Keywords： Bacillus; β-D-glucosidase; gene cloning
　　β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase， BGL）屬纤维素水解酶系重要组成酶，可水解芳基或烃基与糖基间糖苷键生成葡萄糖与苷元[1]。大部分β-D-葡萄糖苷酶对底物糖基结构专一性较差，能水解C-S键、C-N键、C-F键等多种糖苷键。此外，有些对糖基C4和C2结构也不专一，能同时水解β-葡萄糖苷键和β-半乳糖苷糖。甚至，有些β-D-葡萄糖苷酶对C6位专一性也不高，也能水解木糖。因此，β-D-葡萄糖苷酶水解酶能适应多种底物[2]。
　　Bacillus属菌株分布广泛，菌落表面粗糙不透明，可利用蛋白质、多糖及淀粉，能分解色氨酸形成吲哚，在分子遗传操作中应用广泛。至今已从土壤中分离到B. subtilis、B. licheniformis、B. pumilus等多个种，并克隆及表达β-D-葡萄糖苷酶编码基因[3-5]。研究表明，香草兰发酵过程中Bacillus属菌株参与风味物质形成，水解香兰素葡萄糖苷的Bacillus属菌株β-D-葡萄糖苷酶在何种条件下发生催化，如何能达到最大催化效率，如何筛选高效产酶菌株，以便改进发酵方法提高香兰素产量。对分离菌株β-D-葡萄糖苷酶进行研究可为解决上述问题提供参考信息。选择本实验室分离到的2株菌株XY18和XY20进行β-D-葡萄糖苷酶编码基因全长克隆，采用E.coli进行表达，研究β-D-葡萄糖苷酶学性质。通过以上工作，了解2株菌株β-D-葡萄糖苷酶酶学特征。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　菌株Bacillus siamensis XY18、Bacillus subtilis XY20均为中国热带农业科学院香料饮料研究所产品加工研究室保存。
　　1.2  方法
　　1.2.1  RACE扩增bgl全长  采用细菌基因组DNA抽提试剂盒（UNIQ-10，Sangon）提取基因组DNA。基于根据NCBI数据库基因同源性获得的菌株XY18及XY20 β-D-葡萄糖苷酶编码基因部分片段序列，设计引物，采用RA?CE技术扩增获得全长，扩增所采用的引物见表1。
　　1.2.2  质粒重组、融合蛋白表达及纯化  UCm-T载体的重组：目的DNA片段和载体连接采用PCR产物T/A pUCm-T克隆试剂盒（Sangon）进行。反应混合物置于0.5 mL Eppendorf管中16 ℃连接1 h。将重组pUCm-T载体及pET28a（+）/pET28b（+）进行酶切并连接，构建重组载体。菌株XY18使用pET28a（+），菌株XY20使用pET28b（+）。取1 μL重组的pET28b（+）质粒转化BL21菌株，42 ℃热击90 s，冰上静置2 min后涂平板（30 ?g/mL卡那霉素），37 ℃培养过夜。重组的pET28a（+）采用34 ?g/mL氯霉素筛选。小试培养选择最佳的诱导条件后重组蛋白的大量诱导。超声破碎菌体后采用镍琼脂糖亲和层析纯化蛋白。
　　1.2.3  β-D-葡萄糖苷酶酶活的测定  酶的测定方法：取酶液10 μL，加入pH 6.5缓冲液80 μL，再加入50 mmol/L pNPG 10 μL，于37 ℃保温10 min。空白对照以100 ℃灭活2 min酶液代替。反应后，加入1 mol/L Na2CO3 100 μL显色，用酶标仪测405 nm处吸光度（OD405）。1个酶活力单位（U）定义为：pH 6.5、37 ℃条件下，每分钟生成1 μmol pNP所需的酶量。 　　1.2.4  pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性及稳定性的影响  pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性影响测定方法参照Michlmayr等[6]方法并略有改动。维持37 ℃恒定，在pH 4.0～9.0范围内以1.0幅度变化测定pH对酶活影响。维持pH 6.5恒定，在温度25～50 ℃范围内以5.0 ℃幅度变化测定温度对酶活影响。pH 6.5条件下，酶液置于30、40、50、60和70 ℃处理后再测定酶活力。pH 4.0～9.0范围内以1.0幅度变化处理酶液后再测定酶活力。
　　1.3  数据处理
　　采用DNAMAN 6.0构建质粒图谱，数据统计分析采用Excel 2010结合Origin 8.6软件进行处理。
　　2  结果与分析
　　2.1  bgl基因全长获取
　　根据前期研究已获得的β-D-葡萄糖苷酶编码基因bgl部分片段的序列信息，设计引物，采用RACE技术进行染色体位移，扩增获得菌株XY18和XY20 β-D-葡萄糖苷酶编码基因全长，CDS区分别为1398和1410 bp。采用BLASTn进行比对，结果表明，菌株XY18 bgl序列与B. amyloliquefaciens的β-D-葡萄糖苷酶编码基因序列相似性为96%，而菌株XY20 bgl序列与B. subtilis的β-D-葡萄糖苷酶编码基因序列相似性为99%。其反映了获得的序列为Bacillus属菌株β-D-葡萄糖苷酶编码基因。
　　2.2  重组载体构建
　　质粒pET28b（+）与含目的片段（XY20）的重组pUCm-T载体经NdeI、XhoI限制性酶切并构建重组pET28b（+）/bgl表达载体，图1为重组载体pET28b（+）/bgl（以XY20为例）构建框架图。pET28a（+）与来源于XY18目的片段连接。
　　2.3  β-D-葡萄糖苷酶纯化
　　分别將含重组蛋白的E. coli BL21在20和37 ℃进行诱导表达，并以诱导前菌体沉淀作为对照。融合蛋白（54 kDa）在37 ℃诱导比20 ℃诱导条件下表达量高，因此，选择37 ℃诱导菌体上清。纯化后均获得SDS-PAGE水平上单一条带产物，为更进一步确认蛋白纯度与表达量，Western blot显色结果表明，融合蛋白得到大量表达并经纯化后获得单一蛋白产物（图2）。
　　2.4  pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活性的影响
　　以最高酶活100%来衡量pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶活力影响。如图3所示，以pH4.0为起点，随着pH增加，酶活性增加，在pH6.0时酶活性最大;随着pH进一步增加，酶活性逐渐降低。以温度25 ℃为起点，随着温度增加，酶活性增加，直至40 ℃时酶活性最大，然而温度进一步增加后，酶活性迅速降低。
　　2.5  pH、温度对β-D-葡萄糖苷酶稳定性的影响
　　如图4所示，在30～70 ℃范围内，温度越低，酶活性越大，然而2株菌对pH稳定性则略有差异。以pH4.0为起点，随着pH增加，酶活性增加。菌株XY18在pH为6.0时最稳定，菌株XY20在pH为7.0时最稳定。达到最大酶活后，随着pH进一步增加，2株菌株酶活性迅速降低。
　　3  讨论
　　决定香草兰品质最重要因素之一为香兰素含量，而香草兰发酵目的在于让豆荚中香兰素葡萄糖苷接触β-D-葡萄糖苷酶从而水解产生香兰素[7]。对香草兰β-D-葡萄糖苷酶进行纯化发现，该酶分子量为201 kDa，由大小相同的4个亚基组成，最适pH为6.5，最适宜温度为40 ℃[8]。内源β-D-葡萄糖苷酶对香兰素生成的贡献至今仍存在争议。Odoux[9]研究发现，根据香草兰发酵后生成香兰素含量来衡量，在发酵过程中内源β-D-葡萄糖苷酶仅有效利用其催化活性40%，大部分活性都在其发酵过程中丢失。该课题组进一步研究香兰素葡萄糖苷、β-D-葡萄糖苷酶活及细胞组织破裂间关系，他们又提出虽然β-D-葡萄糖苷酶酶活在发酵过程中发生失活，但香兰素葡萄糖苷转化完全。因此认为，β-D-葡萄糖苷酶并未影响香兰素葡萄糖苷的水解程度，只影响其水解速率快慢[10]。本课题组研究已证实，内源β-D-葡萄糖苷酶在发酵过程中并未完全参与香兰素葡萄糖苷水解，在杀青24 h后发生失活，而后续香兰素葡萄糖苷水解则由外源Bacillus β-D-葡萄糖苷酶来完成，因此，对外源Bacillus菌株β-D-葡萄糖苷酶了解，有助于探讨香兰素葡萄糖苷水解机制及改进发酵工艺。
　　β-D-葡萄糖苷酶是一种常见水解酶，之前研究已从Bacillus polymyxa、Aureobasidium pullulans、Bacillus circulans subsp. alkalophilus、Thermobifida fusca分离到产β-D-葡萄糖苷酶菌株，这些菌株都具有较强耐热能力，但由于Bacillus属菌株在参与发酵过程中产生其他异味，且来源于非食品环境，是否可用于发酵尚有待研究[11-14]。菌株XY18、XY20所产β-D-葡萄糖苷酶显示一定耐热能力，说明在发汗、干燥阶段即使环境温度较高，菌株均能存活且起到水解香兰素葡萄糖苷作用。此外，在接近中性环境条件下，酶活力较高，也为提高催化活性所需环境条件提供参考。
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