玉米P1基因表达、蛋白定位预测与功能分析

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　　摘  要：玉米自交系京501和京24属于不同基因型，京501与京24杂交F2代通过3代自交得到F5代株系，PCR检测A-45（11-1）、A-44（10-7）、京24等株系叶片，发现它们含有P1转录因子，液相色谱分析A-45（11-1）、A-44（10-7）、A-37（12-5）、京24等株系籽粒果皮发现，果皮中含有鞣酐，而且它们的果皮表现出不同类型的红色，纸层析和显微观察发现果皮组分含有蛋白质和砖红色物质，所以F5代株系果皮P1转录因子可能来自京24。
　　关键词：果皮;鞣酐;转录因子;玉米
　　中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）08-0009-05
　　Abstract：Maize inbred lines Jing501 and Jing24 are belonging to different genotypes，F5 generations lines containing transcription factor P1 were generated by three selfing cross pollination of Jing 501*Jing24 hybrid F2 generations，PCR assays of gene P1 and analysis of phlobaphene were conducted by HPLC. PCR analysis showed that the P1 transcription facteor was in maize genome of A-45，A-44 and Jing24;HPLC analysis of A-45（11-1），A-44（10-7），A-37（12-5）and Jing24 lines pericarps revealed that the accumulation of red phlobaphene in pericarps. moreover their pericarp appeared different type red color ，we found that pericarp components contains protain and brick red material by microscope observed and paper separate out，These results suggest that the P1transcription factor of F5 generations maybe come from Jing 24.
　　Key words：Pericarp;Phlobaphene;Transcription factor;Maize
　　花青素能在玉米植株大多数器官中积累，然而鞣酐只是在籽粒果皮、穗颖和雄穗中发现[1]，花青素和鞣酐的积累方式不同，花青素在植株发育的整个生育期的营养和花器官组织中都能发现[2]，鞣酐仅在玉米植株发育的后期出现。编码并调解花青素和鞣酐的转录因子不同，Tuerck于1994年研究认为调节砖红色鞣酐合成的转录因子是P1。P1属于R2R3-MYB调节基因家族[3]，编码序列专一性的DNA结合蛋白，具有转录因子功能[4]，调节砖红色鞣酐生物合成。研究表明，P1在籽粒果皮、花丝和穗颖中表达[5]，能观察到的P1最明显的表型在籽粒果皮和成熟玉米穗的穗颖中[6]。
　　本次实验主要研究鞣酐生物合成及P1基因的遗传来源，我们选育一些籽粒果皮含有鞣酐且基因组含有参与鞣酐合成的P1转录因子的株系[7]，给出基因和组化的数据支持我们的试验结果，即籽粒果皮颜色的变化来自于P1转录因子参与并调节的鞣酐片层的累积。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 玉米自交系京501、京24，由陈刚研究员选育;F5代株系材料由京501与京24杂交2代经过几代套袋自交授粉得到，编号分别为A-45（11-1）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、B-14（9-2）、A-47（11-4）、A-40-3（9-5）;京24种子，由北京农科院种业公司陈传永提供。
　　1.2 不同材料的穗基因型和表型 P基因及等位基因的鉴别依靠它们在果皮和穗颖中的表达，P1-rr定义为红果皮红穗轴，P1-wr为是白果皮红穗轴，P1-rw为红果皮白穗轴，P1-ww是白果皮白穗轴[8]，在试验中采用标准的玉米遗传基因分类法[9]，P1基因的鉴别依靠PCR检测叶片和果皮及穗颖色，京24白色果皮，有些有红色斑点，红穗颖，F5代株系A-37（12-5）、A-47（11-4）和A-45（11-1）红果皮和红穗颖，A-44（10-7）和A-40-3（9-5）株系有紅色斑点果皮，白穗颖，B-14（9-2）株系淡红果皮红穗颖（表1）。
　　1.3 果皮成分纸层析与组化染色 取20粒种子，用清水浸泡1h，去掉黑层，剥下果皮阴干后，加几粒石英砂研磨粉碎，然后加4mL蒸溜水，室温提取30min。用层析滤纸吸取上清液，用pH值为4.5的95%的酸性乙醇染色，阴干后用pH值为2的one step blue染色，用pH值为2的酸性考马斯亮蓝R250染色。用吸管吸取上清液滴3滴在载玻片上，用pH值为2的one step blue 染色，用pH值为2的酸性考马斯亮蓝R250染色。从研磨样中取一些碎薄片，用pH值为2的酸性one step blue 染色，用pH为2的酸性考马斯亮蓝R250染色，200倍显微镜下观察并拍照。
　　1.4 果皮成分提取与液相色谱分析 把种子从穗上剥离，取一些籽粒用清水浸泡1h，去掉黑层，剥下果皮晾干并拍照，用研磨仪磨碎，用生物中心的液相色谱检测，1mL冰乙酸溶于500mL纯净水中，pH值3.523，称取0.4g左右的果皮粉碎样，加入5mL提取液（1mL冰醋酸加入500mL水），50℃水浴0.5h，10000转/s离心5min，取上清2mL，阴干至0.5～1mL，过0.22μm膜。用Agilent1100型高效液相色谱仪紫外检测器检测;流动相乙腈和水为60∶40，柱温：室温30℃，流速0.8mL/min，紫外检测波长515nm，进样量20μL，上次用乙醇提取的样品，在室温条件下阴干，加入0.8mL冰乙酸水溶液用于测定，提取时发现有些样品存在溶解不完全现象，参照周波方法并更改（2008）[10]。样品编号分别为A-45（11-1）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、B-14（9-2）、A-47（11-4）、A-40-3（9-5）和京24。 　　1.5 抽样PCR检测4个株系的P1mRNA表达 北京亿鸣复兴生物科技有限公司qPCR实验报告检测4个株系9-5（A-40-3）、10-7（A-44）、11-1（A-45）和京24叶片或幼苗中P1mRNA的表达情况。基因P1引物F：GGAGGAAGAAGACATCATCATCATCAA，R：AGCCAGCACAGCACACACACTG。基因Actin引物F：TCCGCATCTACATCTATACGCTC，R：AGGTCACAGGAGTAGAGTTGCTTT，使用 Genstar-TRIGene總RNA提取试剂按照kit说明提取RNA。反转录，使用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser按照kit说明反转录得到cDNA，反应液10.0μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0μL，lOligdT 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL，Total 10μL;反应条件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保存。PCR体系配置（20μL体系）Taq DNA Polymerase（Mg2+ plus Buffer）0.5μL，PCR Forward Primer1.0μL，PCR Reverse Primer1.0μL，dNTP MIX 0.4μL，DNA模板2.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）13.1μL，Buffer2.0μL，Total 20.0μL，混合均匀，离心加入PCR板里。PCR反应程序设置，温度95℃变性3min，循环数1;72℃退火30s，循环数40，72℃延伸5min，循环数1，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，染色，凝胶成像仪上观察拍照。
　　1.6 玉米P1蛋白分子量计算，亚细胞定位与三级结构预测 玉米P1蛋白登录号CAA77939，通过在线protparam软件计算P1蛋白的氨基酸数，分子量，理论PI，分子式，原子数等，并通过在线wolfpsort蛋白亚细胞定位预测在线软件对P1蛋白进行亚细胞定位预测，通过在线软件phyre2和swiss-mode预测玉米P1蛋白三级结构。
　　2 结果与分析
　　2.1 7个株系籽粒果皮颜色 剥离果皮以后，对不同株系籽粒果皮色进行调查，表明不同株系籽粒果皮颜色存在差异。A-37（12-5）株系籽粒果皮血红色，A-47（11-4）和A-45（11-1）株系籽粒果皮淡红色，京24、A-44（10-7）和A-40-3（9-5）株系籽粒果皮白色，有些有红色斑点，9-2（B-14）株系籽粒果皮红色斑点颜色加深（图1）。
　　2.2 果皮成分试纸检测 通过纸层析，one step blue和考马斯亮蓝R250染色发现7个株系籽粒果皮提取物质在纸上呈线条状分部，考马斯亮蓝R250染色的12-5（A-37）、A-40-3（9-5）和A-45（11-1）株系籽粒果皮提取物质在纸上分上下2层，上层为砖红色鞣酐，下层是蓝绿色蛋白质，one step blue 染色的A-37（12-5）株系籽粒果皮提取物质在纸上分3个部分，上层是砖红色鞣酐，最下层可能是one step blue染色物质，中间零星分布一些蓝绿色蛋白质，B-14（9-2）株系籽粒果皮提取物质也是如此，2种化学试剂染色的A-44（10-7）、京24株系籽粒果皮提取物质上层鞣酐较少，颜色较浅，one step blue 染色的没能完全分离开。
　　2.3 6个株系籽粒果皮碎片染色显微观察 对A-37（12-5）、京24、A-45（11-1）、A-44（10-7）、B-14（9-2）和A-40-3（9-5）6个株系籽粒果皮采用两种化学试剂染色并显微观察发现，6个株系籽粒果皮one step bue 染色以后，都有一些蓝色蛋白分布其中，也有一些呈凝胶状或粉状砖红色物质，考马斯亮蓝R250染色以后，仅能发现一些凝胶状或粉状的砖红色物质，其它为蓝色物质，不染色的对照里面仅能发现一些砖红色物质，其中A-37（12-5）株系籽粒果皮砖红色物质最多。
　　2.4 4个株系P1m RNAPCR检测 为了解P1基因在一些株系中表达情况，选出3个株系叶片进行mRNA的PCR检测，比如A-44（10-7）、A-40-3（9-5）和A-45（11-1），PCR检测结果表明P1基因在这3个株系基因组里并且有表达。同时，为了验证这些株系的P1基因来自京24自交系，对京24自交系进行了2次P1基因mRNA的PCR检测，第1次仅在幼苗中检测到了P1基因有表达，叶片中没有检测到，第2次幼苗和叶片中都检测到了P1基因有表达（图2）。
　　2.5 P1蛋白氨基酸序列分析、定位与结构模型预测 从文献[13]中取得P蛋白序列和部分基因序列，玉米P蛋白登录号CAA77939，通过在线protparam软件预测氨基酸数399，分子量43756.34，理论P110.16，分子式C1879H3029N607O575S15，原子数6102，N端为MET，通过在线wolfpsort蛋白亚细胞定位预测结果表明玉米P1蛋白最有可能定位在细胞核中。在P1蛋白氨基酸组分中，Arg、Ser含量最多，为10%以上，Phe、Met和Tyr含量较少，为1%左右，Pyl和Sec含量几乎没有（见表2）。通过在线软件phyre2和SWISS-MODE预测发现，P1蛋白模型的氨基端氨基酸序列与以前文献的也不完全一样，预测的最终P1蛋白DNA结合结构域模型氨基端序列可能从13号氨基酸到210号氨基酸（图3）。
　　2.6 7个株系籽粒果皮成分液相色谱检测 为了验证籽粒果皮颜色的变化是由鞣酐含量的变化引起的，我们对7个株系籽粒果皮进行了液相色谱检测，发现这些株系籽粒果皮都含有且主要含有一种成分鞣酐，由于编码MYB类转录因子的P1基因在果皮中响应鞣酐累积，所以通过检测这些玉米株系籽粒果皮也证实了这一点（图4峰），即含转录因子P1基因的玉米株系能在果皮中积累鞣酐。 　　3 討论与结论
　　3.1 讨论 红色鞣酐在果皮中合成只有一个前体物质黄烷4醇[12]，鞣酐的产生需要P1调节基因，ZmF3'H编码黄烷酮-3羟化酶参与了鞣酐的生物合成，在玉米中它是P蛋白的直接目标[13]，Grotewold在1994年[14]研究认为，通过选育P1调节基因能够得到果皮中富含鞣酐的种子，P1蛋白是myb类蛋白，识别序列CCT/AACC，有的文献报道A1启动子需要P1蛋白的转录活化，P1蛋白氨基端结合A1基因启动子重叠序列ACCT/AACC即-65～-54区域，转录激活A1启动子-123～-109区域使A1基因转录生成二氢黄酮醇还原酶[15-16]。本试验用F5代株系中P1转录因子调节基因可能来自果皮带有红色斑点的京24，PCR检测到了A-45（11-1）、A-44（10-7）、A-40-3（9-5）和京24株系的P1基因的mRNA表达，液相色谱分析了A-37（12-5）、A-45（11-1）、京24、A-47（11-4）A-40-3（9-5）和B-14（9-2）株系籽粒果皮表明果皮中有鞣酐存在。在本次试验研究中，观察到A-45（11-1）和A-37（12-5）株系籽粒果皮鞣酐累积增加了，果皮红色加深，所以P1基因对果皮中鞣酐生物合成具有重要调节作用。京24是白色果皮带红色斑点，红色鞣酐在果皮有少量累积，没有其他株系的多，可能合成路径不同或基因序列不同，也可能与侧翼区甲基化[17]，降低转录且抑制表达[18]，或象有的基因型一样干扰稳定的组织专一性鞣酐合成基因的表达有关[19]。
　　3.2 结论 由本次研究可知，通过杂交选育得到了一些籽粒果皮颜色不同的株系，有的株系籽粒果皮红色加深，鞣酐含量提高。研究初步揭示了果皮色改变的调节机制，F5代株系中的P1调节基因来自京24玉米自交系，玉米P1蛋白表现出组织专一性的转录调控，对于阐明不同玉米基因型籽粒果皮鞣酐生物合成具有重要意义。
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