北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡精液品质比较及C2CD2和RYR2基因的差异表达分析

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　　摘要 [目的]比较北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精液品质和性腺发育情况，并分析2品种间C2CD2和RYR2基因的表达差异。[方法]试验选取33周龄北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡各32只，从35周龄开始进行为期10周的精液品质检测。从2品种的每个重复中随机挑选1只种公鸡进行屠宰，记录其活体重、左右睾丸重以及鸡冠重并分析睾丸指数等，应用荧光定量PCR方法检测C2CD2和RYR2基因在2品种睾丸组织中的表达水平。[结果]海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精子密度、精子总数和性腺发育情况均优于北京油鸡。C2CD2基因在北京油鸡中的表达量高于海兰褐壳蛋鸡，而RYR2基因在北京油鸡中的表达量显著低于海兰褐壳蛋鸡（P<0.05）。[结论]海兰褐壳蛋鸡的精子密度、精子总数和性腺发育情况均优于北京油鸡，RYR2基因可作为提高鸡精子总数的候选基因。
　　关键词 精液品质；精子总数；北京油鸡；海兰褐壳蛋鸡；C2CD2基因；RYR2基因
　　中图分类号 S831.5 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0100-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.029
　　Abstract [Objective] To compare the semen quality， gonadal development status of cock bred between BeijingYou chicken and Hyline brown laying hens， and analyze the differential expression of C2CD2 and RYR2 genes between the two breeds. [Method] 32 33weekold cock breeds of BeijingYou chicken and Hyline brown laying hens were selected. The semen quality testing was carried out for 10 weeks from 35weekage. One cock bred was randomly selected for slaughter from each repeat of two breeds， and the live weight， left and right testis weight and comb weight were recorded and the testicle index was analyzed. The expression level of C2CD2 and RYR2 genes in testicular tissue of two breeds was detected by Realtime PCR.[Result] The sperm density， total sperm count and gonad development of Hyline Brown laying hens were better than those of BeijingYou chicken. The expression amount of C2CD2 gene in BeijingYou chicken was higher than that of Hyline Brown laying hens， and the expression amount of RYR2 gene in BeijingYou chicken was significantly lower than that of Hyline Brown laying hens（P<0.05）. [Conclusion] The sperm density， total sperm count and gonad development of Hyline Brown laying hens were better than that of BeijingYou chicken. RYR2 genes can be used as candidate genes for total sperm count of chicken.
　　Key words Semen quality；Total sperm count；BeijingYou chicken；Hyline brown laying hens；C2CD2 gene；RYR2 gene
　　隨着现代集约化高效养禽业的发展，人工授精技术在实际生产中已经普遍应用。在大规模种鸡生产中，种蛋受精率会影响种蛋和雏鸡的质量，也会影响孵化率，从而影响育成期的产蛋性能，最终影响蛋鸡养殖场的经济效益[1-3]。精液品质是决定种蛋受精率的重要因素之一。北京油鸡是我国的优良地方品种，肉蛋品质兼优，但产蛋量较低。海兰褐壳蛋鸡是美国海兰国际公司培育的四系配套优良蛋鸡品种，饲料报酬、产蛋量和成活率均较高[4-5]。笔者选取这2个有代表性的品种进行精液品质和性腺发育情况的比较。
　　C2CD2（C2 domaincontaining 2）和RYR2（ryanodine receptor 2）基因均在维持细胞内钙稳态过程中发挥生物学作用，而细胞内钙稳态以及Ca2+浓度在生精细胞分化成熟、精子顶体反应和获能过程中均发挥着重要的作用。因此，研究C2CD2基因和RYR2基因在北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡中的表达差异，可为鸡精液品质的候选基因挖掘奠定理论基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验动物
　　试验选取33周龄、体况一致的北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡各32只。将每个品种进行随机分组，每个品种4个重复，每个重复8只鸡。试验鸡饲养与管理条件相同。 　　1.2 测定指标与方法
　　1.2.1 人工采精和精液品质的测定。
　　试验群体由33周龄饲养至45周龄，从35周龄起进行每周2次定时定员的人工采精。将集精杯提前预热，经腹部按摩法采集精液后，直接在集精杯上读数，确定其精液量。将采集的精液以1∶400的比例稀释，吸取1滴精液滴入计数池，置于显微镜下，采用伟力鸡精子分析系统对精子活率、精子活力以及精子密度进行检测。每个样品至少选取5个不同视野进行分析。
　　1.2.2 性腺发育相关性状的测定。
　　45周龄时，从每个品种的每个重复中随机选取1只鸡，称量活体重后屠宰。宰前禁食12 h，自由饮水。屠宰时采用颈外放血法，切断鸡颈动脉或颈静脉，放血致死。采集睾丸和鸡冠组织，称重后置于液氮中保存。
　　1.2.3 荧光定量PCR检测基因表达水平。
　　采集2个品种的左睾丸组织，应用Trizol法提取样本总RNA，测定浓度后按体系用Thermo First cDNA Synthesis Kit SinoGene试剂盒进行反转录，然后应用StepOnePLUS，Applied Biosystems PCR仪进行定量反转录，每个样品每个基因设置3个平行进行PCR检测。以β-actin作为内参基因，采用荧光定量PCR方法检测C2CD2和RYR2基因在2品种睾丸组织中的表达量。根据GenBank中的基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物（引物序列见表1）。相对定量的结果采用2- ΔΔCt法进行计算。
　　1.3 数据统计与分析
　　试验结果均以平均值±标准差表示。采用 SPSS 22.0统计软件的独立样本t检验进行差异显著性分析，其中P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
　　2 结果与分析
　　2.1 北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精液品质比较
　　对北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精液品质进行比较，结果表明北京油鸡的精液量极显著高于海兰褐壳蛋鸡（P<0.01），北京油鸡的精子活率和精子活力均显著高于海兰褐壳蛋鸡（P<0.05）；但海兰褐壳蛋鸡的精子密度极显著高于北京油鸡（P<0.01），故海兰褐壳蛋鸡的精子总数极显著高于北京油鸡（P<0.01）（表2）。
　　2.2 北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡的性腺发育情况比较
　　对北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡的性腺发育情况进行比较，结果表明海兰褐壳蛋鸡的活体重和鸡冠重均极显著高于北京油鸡（P<0.01）；海兰褐壳蛋鸡的平均睾丸重以及睾丸指数亦高于北京油鸡，但差异不显著（P>0.05）（表3）。
　　2.3 北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡C2CD2和RYR2基因的表达水平比较
　　应用荧光定量PCR方法检测北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡C2CD2和RYR2基因的表达水平，结果表明C2CD2基因在2品种公鸡间表达量无显著差异，但其在北京油鸡中的表达量高于海兰褐壳蛋鸡，而RYR2基因在海兰褐壳蛋鸡中的表达量显著高于北京油鸡（P<0.05）。
　　3 讨论
　　3.1 精液品质差异
　　该研究分别对北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡精液品质进行了测定，结果表明北京油鸡种公鸡的精子活力和活率显著高于海兰褐壳蛋鸡，与王竹伟等[6]、史好赞等[7]和胡娟[8]的试验结果基本一致。
　　该研究结果表明北京油雞种公鸡的精液量极显著高于海兰褐壳蛋鸡，但海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精子密度远高于北京油鸡，这与前人的研究结果[9-14]基本一致。Kamar[15]研究发现精液量与繁殖力呈正相关；Boone[16]研究表明精液量与繁殖力呈负相关。但他们同时认为精子密度与繁殖力存在显著正相关，相关系数分别为0.821和0.481。Nestor等[17]研究表明火鸡在生产前期精子密度与繁殖力的相关性不显著，但在后期存在强的正相关。因此，为更好地反映精液品质，常将精液量和精子密度综合为精子总数进行考虑。该试验结果表明海兰褐壳蛋鸡的精子总数极显著高于北京油鸡。
　　北京油鸡作为肉蛋兼用品种，繁殖力相对较低，这妨碍了其产业发展，因此改善其繁殖性能十分重要。该试验结果表明，北京油鸡种公鸡的精子活力和精子活率较高，但在精子密度和精子总数上仍需进一步选育提高。
　　3.2 性腺发育情况比较
　　该试验在45周龄时对北京油鸡和海兰褐壳蛋鸡种公鸡进行屠宰，测定其性腺发育相关性状，结果表明海兰褐壳蛋鸡的活体重和鸡冠重均极显著高于北京油鸡，而北京油鸡与海兰褐壳蛋鸡种公鸡的平均睾丸重以及睾丸指数虽然无显著差异，但海兰褐壳蛋鸡的这2项指标均高于北京油鸡，海兰褐壳蛋鸡种公鸡的睾丸发育情况优于北京油鸡。睾丸作为精子发生的场所，其发育情况与精液品质息息相关。Hassanin等[18]研究表明睾丸指数以及睾丸发育情况是衡量性腺发育的重要参数，在一定范围内公鸡的繁殖能力与睾丸指数呈正相关。
　　3.3 C2CD2和RYR2基因的表达分析
　　C2CD2基因主要的分子功能是与蛋白结合，是存在于膜上的单通道蛋白。Petrie等[19]研究表明C2结构域可调节囊泡胞吐作用。董干[20]研究发现C2CD2基因在精索静脉曲张不育患者（生精功能受损）精浆中的表达量显著高于正常人，C2CD2基因的异常表达与精索静脉曲张不育具有显著相关性，可作为精索静脉曲张患者的不育标记物。该试验中C2CD2基因在北京油鸡睾丸组织中的表达量高于海兰褐壳蛋鸡，可能是因为其影响了胞吐作用，从而降低了蛋白间的结合能力，进而影响生精过程。RYR2基因编码了一种赖氨酸受体，这种编码蛋白质是细胞内钙释放通道的组成部分，在保持胞内钙平衡功能中起着重要作用。Cheung等[21]和Zhao等[22]研究表明，当 RYR2磷酸化水平增高时，其对Ca2+通透性增高；反之，则其对Ca2+通透性下降。细胞内钙稳态以及Ca2+浓度在生精细胞分化成熟、精子顶体反应和获能过程中均发挥着重要作用。Chiarella等[23]研究表明，RYR2基因在小鼠的精原细胞中表达，并通过调节Ca2+浓度促进精原细胞分化。该试验结果表明RYR2基因在海兰褐睾丸组织中的表达量显著高于北京油鸡，可能其高表达量有利于精子生成过程。因此，RYR2基因可作为提高鸡精子总数的候选基因，但其在睾丸组织中的具体调控机理仍有待进一步研究。 　　4 结论
　　海兰褐壳蛋鸡种公鸡的精子密度、精子总数和性腺发育情况均优于北京油鸡，RYR2基因可作为提高鸡精子总数的候选基因。
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