靶向Slug基因表达对体外胰腺癌细胞生物行为的影响
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【摘要】Slug基因在多种恶性肿瘤中存在明显上调,Slug上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后[1-2]。后来发现[3]Slug既能下调肿瘤细胞内E-cadherin表达,又能上调细胞内VEGF蛋白表达,因此,Slug与恶性肿瘤转移和血管生成有关。Hotz等[4]新近发现,胰腺癌组织及高转移潜能的胰腺癌细胞株存在Slug的明显上调。
【关键词】Slug基因;胰腺癌;影响Target to Slug gene expression to vitro pancreatic gland cancer cell biology behavior influence
Wang Ximan1 Zhuang Kelin2 Liu Yifei2 et al.
【Abstract】The Slug gene has the obvious upward in many kinds of m alignant tumors, the Slug upward tumor easy to present the distant place shift, the deep tumor infiltration depth and bad prognosis[1-2] . Afterward discovered [3]Slug both to be able to decline in the tumour cell E-cadherin to express, and could surrender to the state in the cell the VEGF protein to express, therefore, Slug and the m alignant tumor shift and the blood vessel production concerned. Hotz and so on [4]recently discovered that the cancer of the pancreas organization and the high shift potential’s cancer of the pancreas cell line has Slug the obvious upward.
【Key words】Slug gene; Cancer of the pancreas; Influence
【中图分类号】R776.1【文献标识码】B【文章编号】1002-574X(201009-0019-02
Slug基因在多种恶性肿瘤中存在明显上调,Slug上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后[1-2]。后来发现[3]Slug既能下调肿瘤细胞内E-cadherin表达,又能上调细胞内VEGF蛋白表达,因此,Slug与恶性肿瘤转移和血管生成有关。Hotz等[4]新近发现,胰腺癌组织及高转移潜能的胰腺癌细胞株存在Slug的明显上调。我们推测,干扰Slug能抗胰腺癌转移作用。
基于上述理论,本课题旨在研究Slug干扰对胰腺癌侵袭转移和血管生成的影响,为抗胰腺癌转移提供新的基因靶点。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂:RPMI1640购于Hyclon公司,小牛血清购于杭州四季青公司,胰酶为国产。质粒提取试剂盒购于AXYGEN,连接试剂盒RNA提取试剂、cDNA合成及PCR扩增试剂, G3PDH购于TaKaRa;质粒提取试剂盒购于AXYGEN, Millicell(小室)由MilliPore公司生产,Matrigel和6孔板购于美国BD公司。Slug-shRNA-1和shRNA-1质粒由海口市人民医院 王齐全教授惠送,兔抗人多克隆抗体Slug购于SANTA CRAUZ公司。
1.1.2细胞株和裸鼠:AsPC-1胰腺癌 细胞株购于中国科学院上海生物研究所细胞库,细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养,细胞培养条件为37°C恒温,饱和湿度和5% CO2,指数生长的细胞为实验对象。取4周龄健康纯种BALB/c-nu/nu雌性裸鼠,体重18～22g,在海南医学院动物实验中心SPF级饲养,称重,编号。实验对象共分为三组:阴性对照组,空白对照组和实验组。
1.2方法
1.2.1基因转染及稳定表达细胞株的筛选:AsPC-1细胞在含有10 %小牛血清的DMEM培养基中,37℃、5 %CO2条件下培养。用0. 25 %的胰酶消化细胞后,按每孔4×104个细胞均匀加入96孔板中,培养至细胞85%～90 %汇合后,分别转染pSlug-siRNA和pNeg-siRNA质粒,具体操作按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 说明书进行。转染24 h 后将细胞以1∶10 比例传代,次日开始用含有500μg/ mL G418 的培养基进行筛选培养,每3d更换一次培养基,连续筛选3 周,然后将获得的细胞克隆,扩大培养。
1.2.2RT-PCR测定:按TRizol试剂盒( Invitrogen公司)说明书操作提取稳定转染Slug-shRNA-1和shRNA-1质粒和对照组细胞总RNA,取1μg RNA模按RT试剂盒说明书反转录得到cDNA。引物序列Slug(156bp):R:5’-GCAGACGACGGGTCAGAT-3’,F:5’-GACTGACCCGTCGTGACG-3’反应条件:50℃ 30分钟, 94℃ 2分钟, 94℃ 30秒, 55℃ 30秒,72℃ 1分钟, 72℃延伸7分钟,28循环。取5μL 反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用SYNGENE型凝胶成像系统照像,以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。试验重复3次,数据以x±s表示。
2.3Western-blot测定:提取细胞总蛋白;SDS-PAGE分离胶浓度为12%,积层胶浓度为5%,上样量为15μg•L-1;SDS电泳:恒流,每块板20～40mA,电泳时间约2 h;转膜:恒流,每张膜42mA,时间:3.5h。
2.4体外侵袭实验:按照文献[5]方法将matrigel按40ul.孔-1均匀地铺在膜上,37℃成胶30分钟,置紫外灯照射过夜,实验前再次成胶30分钟。待培养的肿瘤细胞达80%饱和度时,消化、计数,取不同处理组细胞2.0×10个,分别接种到成胶的millicell内,将millicell小室置于24孔板内,用含10%BS的RPMI1640培养液培养48小时。培养48小时后,取出millicell用棉头擦掉matrigel,,少量PBS洗3次,95%的乙醇固定15分钟,HE染色,揭下millicell膜反贴在载玻片上。结果判定:在200倍光镜下,每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数,并计算每个视野的平均穿膜细胞数。
2.5鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验检测血管生成:文献[6]方法进行实验。血管记数: 在电脑屏幕上随机选取5个视野,计算屏幕范围内可见的血管分支点的数量,取其平均数。血管生成抑制率按照下面的公式计算:血管生成抑制率(%)=(1-实验组(阴性对照组)血管分支点数/空白对照组血管分支点数)×100%。
2.6CAM成瘤试验按照文献[7]:方法建立裸鼠腋下胰腺癌移植瘤模型,待2周后肿瘤形成并长至一定体积后,称重裸鼠,按1×1012v.g./kg的剂量标准瘤体内多点注射rAAV2-EGFP-slug-siRNA-U6和rAAV2-EGFP,空白对照组只注射生理盐水。次日无菌条件下切取肿瘤组织,剪成1mm3大小的组织块,生理盐水漂洗后接种在CAM的相对无血管区,用灭菌透明胶纸封闭卵壳开口,平放入温箱中继续孵育,停止转蛋,透过胶纸观察成瘤情况,每组制作6个模型。接种7天后,揭去胶纸,加入预冷固定液固定30min ,待CAM血管内的血液完全凝固后完整剪下CAM,然后按照文献[8]方法进行HE染色。镜下观察,照相。
2.7MTT测定:3组细胞分别消化成单细胞悬液接种于96孔培养板,104细胞/孔,每孔加入200μl含10%FBS的高糖DMEM液,分别培养72h,每组设3个复孔,后续方法参照文献[8]进行,实验重复3次,结果用x±s表示。
3统计学方法
应用SPSS 1010软件进行统计学分析,实验结果用x±s表示,采用t检验。
4结果
(1)稳定转染后细胞中Slug mRNA表达的变化对照组、shRNA-1、Slug-shRNA-1组细胞Slug mRNA表达水平分别为0.826 ±0.040、0.812 ±0.042、0.1467±0.010,差异有统计学意义( P < 0.05 ),说明Slug-shRNA-1组细胞Slug mRNA表达被有效沉默。
(2)Western-blot检测:Slug-shRNA-1组Slug 蛋白表达水平显著受抑(P<0.05),而shRNA-1组与空白对照组无明显改变(P>0.05),说明Slug-shRNA-1组细胞Slug被有效沉默。
(3)细胞侵袭实验:Slug-shRNA-1组穿透基底膜细胞数(38±6.56)明显少于空白对照组穿膜细胞数(164±15.39)及shRNA-1组穿膜细胞数(159.67±8.96),P<0.05,空白对照组穿膜细胞数与shRNA-1组穿膜细胞数无显著性差异,P>0.05。
(4)Slug-siRNA抑制新生血管的生成:观察10日龄的CAM数码相片,对照组和阴性对照组的细胞培养液上清刺激的CAM可见血管密集丰富,呈脉络样改变,血管分支增多,有大量新生血管出现,可见新生血管生长形成中、粗血管,并在中、粗血管继续分支出细小血管,形成新的血管网。但实验组的CAM血管增加不明显,血管网络形成不完全,仍以粗、中血管为主。计数血管分支点数,结果和大体观察一致,实验组的血管分支点均少于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)
(5)CAM成瘤试验。大体观察:肿瘤接种后次日即可见瘤体已粘附于CAM上,周围有少量清色组织液。48h观察所有三组种植瘤的体积都有不同程度的缩小,瘤体变圆,轮廓变模糊,肉眼观部分组织呈轻度自溶,肿瘤周围可见明显的环行水肿区,同时可看见CAM上已有细小血管开始向肿瘤方向生长。此后阴性对照组和空白对照组肿瘤保持良好的生长状态,体积逐渐增大,组织明显变厚,瘤体呈淡红色,肿瘤血供丰富,形成以肿瘤为中心的放射状血管床,接种7天时的成瘤率为100%,两组间肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)。同时可见实验组的肿瘤生长缓慢,接种7天时的成瘤率亦为100%,但瘤体增长速度滞后于两个对照组,差异有统计学意义(P<0.05),CAM上瘤体周围也可见放射状血管网,但血管稀疏,多数血管较细小,未见粗大的供血血管,瘤体较苍白,肿瘤生长抑制率为85.5%,明显高于阳性对照组的5.0%。
HE染色病理切片检查:镜下见肿瘤组织是由形态各异、大小不一,核质比例大的细胞构成,细胞排列混乱,间质少。实验组见瘤组织与CAM 分界清晰,瘤体内着色血管不明显。阴性对照组和空白对照组见瘤组织与CAM粘附紧密,间隙不明显,部分瘤组织浸润CAM,浸润细胞胞体较大,有伪足,瘤体附近有血管形成,并可见瘤体内血管。
(6)MTT测定:对照组和Neg-siRNA两组细胞生长能力差异无统计学意义(P>0.05)。而实验组细胞的生长能力较低,细胞增殖明显滞后于前两组细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。
5讨论
胰腺癌仍然是临床治疗最为困难的消化道恶性肿瘤之一。胰腺癌对目前使用的化疗和放疗等治疗方法具有高度的抵抗性,新的药物如Gemcitabine,虽然已经成为中晚期胰腺癌治疗的首选用药,但最终会产生耐药性,上述方法除了能达到减压和减轻疼痛症状的目的外,却不能控制胰腺癌肿瘤的生长和浸润转移,也不能显著延长患者的中位生存时间,因此需要探索新的胰腺癌治疗方法。基因治疗被寄予厚望。
分子靶向治疗是现代肿瘤治疗领域的突破性和革命性的发展, 代表了肿瘤生物治疗新的发展方向。分子靶向治疗是以病变细胞为靶点的治疗,许多靶点药物已进入临床前和临床研究. 但靶点药物中只有少数药物对某些肿瘤效果显著, 例如: 格列卫, 贺赛汀. 分子靶向药物对胰腺癌的治疗作用不明显, Celecoxib是靶向COX-2(环氧化酶)的药物, 目前与吉西他滨联合治疗的2期临床试验, 只有17%的患者获部分缓解.肿瘤分子靶向治疗虽然取得了一定的疗效,但面临更多的是挑战: 疗效差, 只有10%左右患者取得客观反应; 有效期不长, 需持续不断用药,停药复发进展; 所有靶向药物缓解时间有限; 靶向药物不可能完全选择性作用于肿瘤细胞, 不可能对机体没有毒性; 临床前及临床开发研究成本高昂, 因此价格昂贵, 每月达2-10万. 除此之外,目前大部分肿瘤的分子学分型仍不健全或空白,但分子靶向治疗超前于分子分型诊断. 上述存在的各种原因使靶向药物的应用受到了限制。
Slug是转录因子SNAIL家族中编码锌指蛋白的基因,Slug既能下调肿瘤细胞内E-cadherin表达,又能上调细胞内VEGF蛋白表达,因此,Slug与恶性肿瘤血管生成有关。多个研究报道,Slug在多种恶性肿瘤中存在明显上调,Slug上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后[1-3]。尽管某些肿瘤slug上调不显著,例如:结直肠癌,但slug阳性表达与Dukes分期、远处转移和患者预后明显相关,干扰Slug可能抗胰腺癌血管生成和转移作用。
本研究将Slug-shRNA-1作用于ASPC-1细胞后,Slug的蛋白水平和基因水平都受到明显的抑制,说明Slug基因被有效沉默。
本研究用Matrigel模拟基底膜建立体外侵袭模型,通过Slug-shRNA-1干扰ASPC-1细胞Slug基因后,研究其侵袭和转移能力影响.结果发现:实验组穿膜细胞数明显低于空白对 照组及阴性对照组,而空白对照组及阴性对照组间无明显差异,提示RNA干扰Slug基因可降低胰腺癌细胞的侵袭潜力。鸡胚实验说明,干扰slug表达抑制血管生成。CAM成瘤试验说明,干扰slug表达后,肿瘤的血管生成被抑制。我们进一步检测了slug抑制后对体外培养的肿瘤细胞生长的影响,结果表明胰腺癌肿瘤细胞的生长明显被抑制。
综上所述,Slug与肿瘤的侵袭转移和血管生成有关,通过siRNA干扰Slug基因可降低人胰腺癌细胞的血管生成和侵袭转移潜能,从而抑制胰腺癌肿瘤生长,为抗胰腺癌转移和血管生成的基因治疗提供了有力理论基础。
参考文献
[1]Tripathi MK, Misra S, Chaudhuri G. Negative regulation of the expressions of cytokeratins 8 and 19 by SLUG repressor protein in human breast cells. Biochem Biophys Res Commun 2005;329:508-515
[2]S, Aikou T.Slug expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2005;11: 1174-1180
[3]Vannini I, Bonafe M, Tesei A Short interfering RNA directed against the SLUG gene increases cell death induction in human melanoma cell lines exposed to cisplatin and fotemustine .Cell Oncol. 2007;29(4):279-87
[4]Birgit Hotz,Marco Arndt,Sonja Dullat,et al.Epithelial to Mesenchymal Transition:Expression of the Regulators Snail,Slug,and Twist in Pancreatic Cancer.Clinical cancer Research.2007:13:4769
[5]张克君,李德春,朱东明,等.重组腺病毒mIКBa基因的构建及体外抑制血管生成的作用 苏州大学学报:医学版2006;25(4):256-259
[6]张克君,李德春,朱东明,等.重组腺病毒mIkBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察 .中华放射医学与防护杂志.2007;27(5):454-457
[7]张克君,李德春,朱东明,等.PUMA基因转染胰腺癌AsPC-1细胞增强对5-FU致凋亡的敏感性.中国肿瘤生物治疗杂志.2008;23(2):132-134
[8]Bhattacharyya M, Lemoine NR. Gene therapy evelopments for pancreatic cancer. Best Pract ResClin Gastroenterol 2006; 20:285-298
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