制备一种由纯化学成分合成的伊红美蓝琼脂培养基

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　　摘  要：比较评价三种配方的伊红美蓝琼脂培养基（EMB），筛选出一种培养效果优，成本低的纯化学合成培养基，消除现市售伊红美蓝培养基中因蛋白胨营养成分不明确对菌落生长带来的干扰，提高结果准确率。以20种氨基酸为氮源，3个浓度（8.08g、10.0g、20.0g）代替现市售伊红美蓝琼脂培养基中的动植物源性蛋白胨成分，制成纯化学合成伊红美蓝琼脂培养基，比较多种菌株在此培养基上的颜色、菌落形态及生长率。结果表明大肠埃希菌在EMB-1、EMB-2、EMB-3和市售EMB上生长良好，菌落呈黑色，有或无金属光泽，生长率均大于0.7;金黄色葡萄球菌均受到抑制，生长微弱或不生长;沙门氏菌的生长率在自配EMB与市售EMB上相差不大，均为无色菌落。使用全自动生化鉴定仪分析EMB-1和市售EMB上的大肠埃希菌，结果63项生化试验完全一致。综合菌落形态特征、生长率、生化反应、原料成本等因素，选择第1种配方（10.0g）的纯化学合成伊红美蓝琼脂培养基，为纯化学参考物质体系的建立提供一定的数据及实物支撑。
　　關键词：纯化学伊红美蓝琼脂培养基;大肠埃希菌;动植物源性蛋白胨
　　中图分类号：Q93           文献标志码：A      文章编号：2095-2945（2020）15-0001-06
　　Abstract： By comparing and evaluating the three formulations of eosin methylene blue （EMB） agar medium， a pure chemical synthesis medium with excellent culture effect and low cost was selected to eliminate the interference to colony growth caused by unclear nutritional composition of peptone in eosin methylene blue agar medium sold in the market， and improve the accuracy of the results. The pure chemical synthetic eosin methylene blue agar medium was prepared using 20 kinds of amino acids as nitrogen source and 3 concentrations （8.08g， 10.0g， 20.0g） instead of animal and plant-derived peptone in eosin methylene blue Agar. The color， colony morphology and growth rate of many strains on this medium were compared. The results showed that Escherichia coli grew well on EMB-1， EMB-2， EMB-3 and commercial EMB， the colony was black， with or without metallic luster， the growth rate was more than 0.7; Staphylococcus aureus was inhibited， the growth rate of salmonella was weak or non-growing， and the growth rate of salmonella was almost the same in self-made EMB and commercial EMB， all were colorless colonies. Using automatic biochemical analyzer to analyze Escherichia coli on EMB-1 and commercial EMB， the results of 63 biochemical tests were consistent. Considering the colony morphological characteristics， growth rate， biochemical reaction， raw material cost and other factors， the first formula （10.0g） pure chemical synthetic eosin methylene bluec agar medium was selected to provide some data and physical support for the establishment of pure chemical reference material system.
　　Keywords： pure chemical eosin-methylene blue （EMB） agar medium; Escherichia coli; animal or plant peptone
　　大肠埃希菌（E. coli）即大肠杆菌，是医院最常见的革兰氏阴性致病菌[1]。原料加工过程、外包装污染、生产环节或灭菌不够彻底等原因都会导致大肠埃希菌超标，国内外通常将其作为食品药品等卫生状况的指示菌。有研究报导革兰氏阴性菌如大肠埃希菌等对多种药物耐受[2]，因此提高检验结果的准确性非常必要。微生物培养在微生物研究中仍然是一个重大挑战，纯培养及其分离对于研究微生物形态、生理特性、基因序列、代谢功能及微生物生态效应是非常重要的[3]。伊红美蓝琼脂培养基（eosin-methylene blue medium，简称EMB）用于革兰氏阴性肠杆菌的分离、鉴定，特别是大肠杆菌的分离与鉴定。目前市售伊红美蓝培养基中均含有天然动植物源性或微生物源性蛋白胨，组成复杂且营养成分不明确，蛋白胨不同组成的培养基培养的微生物生长情况有明显的差异[4-5]，对菌落生长及后续分析带来许多干扰，并且难以人为控制。在2016年中国Wu X等人报道了一种培养间充质干细胞的无血清纯化学合成培养基[6]。2016年赵新宇等人以高产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10 （pP43SNT-SsacC）为出发菌株通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基[7]。目前的合成培养基只有西蒙氏柠檬酸盐培养基、葡萄糖胺培养基、磷酸盐缓冲液、Cary-Hlair氏运送培养基、察氏培养基、改良察氏培养基、高盐察氏培养基和亚硝酸盐蔗糖琼脂。因此研发无动植物源性纯化学成分的该种培养基迫在眉睫，且可以为我国食品纯化学参考培养基体系的建立提供一定的数据及实物支撑。 　　1 材料与方法
　　1.1 菌株
　　鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC25922、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、产气肠杆菌ATCC13048、白色念珠菌 CMCC98001、福氏志贺氏菌CMCC51571为本实验室保藏。
　　大肠埃希菌ATCC8739、大肠埃希菌CMCC44829、肺炎克雷伯菌CMCC46117、奇异变形杆菌 CMCC49005、肺炎克雷伯菌CICC24165、痢疾志贺氏菌CMCC51105由中国食品药品检定研究院提供。
　　1.2 培养基及试剂
　　1.2.1 营养琼脂、胰酪大豆胨琼脂培养基、营养肉汤、沙氏葡萄糖琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基购自广东环凯微生物公司、北京三药科技公司、北京陆桥技术股份有限公司、美国BD公司。
　　1.2.2 甘氨酸购自Alfa Aesar;丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸水合物、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺（游离）、半胱氨酸（游离）、谷氨酰胺（游离）、色氨酸（游离）、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、D-乳糖、伊红、美蓝购自Sigma;氯化钠、尿素购自沪试;琼脂购自北京奥博星生物公司。
　　1.3 工作菌悬液的制备
　　将大肠埃希菌 ATCC25922、ATCC8739、CMCC44829、 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、CMCC50115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212、肺炎克雷伯菌CMCC 46117、CICC24165、痢疾志贺氏菌 CMCC51105、福氏志贺氏菌CMCC51571、蜡样芽孢杆菌 ATCC11778、产气肠杆菌ATCC13048、奇异变形杆菌 CMCC49005、白色念珠菌 CMCC98001 接种到脑心浸出液肉汤、胰酪大豆胨琼脂平板或沙氏葡萄糖琼脂平板培养过夜。
　　1.4 划线接种
　　将过夜菌稀释约200 CFU/100？滋L，取稀释好的菌悬液100？滋L，均匀涂布接种于待测平板和参比平板，平行接种2个平板，36℃培养18h～24h;取一环过夜培养的菌在平板上划线， 36℃培养18h～24h。
　　1.5 培养基制备
　　将表1所示的20种氨基酸在涡旋仪上混合30min以上，将表1中的5种无机盐在涡旋仪上混匀30min以上，以确保充分混匀，制备成蛋白胨替代物。按照表2称量（自配1培养基以下简称EMB-1，自配2培养基以下简称EMB-2和自配3培养基以下简称EMB-3），溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至7.1±0.2，121℃高压灭菌15 min，冷却至55℃倾注平板备用[8]。
　　2 结果
　　2.1 试验菌株在EMB上的颜色、菌落形态
　　选择几种医院常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、芽孢菌以及真菌等致病菌，将各菌种分别划线接种于市售EMB、EMB-1、EMB-2、EMB-3平板上，通过比较其颜色、菌落形态及生长率来确定最优配方。试验结果见图1。
　　大肠埃希菌ATCC8739在四种平板上均呈黑色菌落，生长良好，其中市售EMB平板上的金属光泽最明显，EMB-1金属光泽比较明显，EMB-2、EMB-3金属光泽不明显。志贺氏菌、奇异变形杆菌在四种培养基上均生长良好，菌落呈无色。产气肠杆菌菌落为粉色，生长良好。肺炎克雷伯菌呈紫色粘液状，生长良好或微弱，EMB-1上生长情况与市售EMB更为接近。革兰氏阳性菌中的粪肠球菌与金黄色葡萄球菌在市售EMB和自配EMB-1、EMB-2和EMB-3培养基上生长均受到一定程度的抑制，微弱生长或不生长，其中EMB-1和EMB-2的抑制能力更强。
　　 蜡样芽胞杆菌ATCC11778在市售EMB和EMB-1均生长良好，白色菌落，不透明，EMB-2生长微弱而EMB-3不生长。白色念珠菌CMCC98001在市售EMB和EMB-1均生长良好，而在EMB-2和EMB-3上生长微弱。
　　2.2 试验菌株在EMB培养基上的生长率对比
　　选取革兰氏阴性菌大肠埃希菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC6538，分别测定其在市售EMB、EMB-1、EMB-2和EMB-3上的PR值，结果如图2所示，在自配的三种EMB与市售EMB上，大肠埃希菌生长良好，菌落形态一致，在EMB-1、EMB-2、EMB-3和市售EMB上的PR值均大于0.7，符合GB4789.28-2013[9]要求。鼠傷寒沙门氏菌ATCC14028在EMB-1、EMB-2和EMB-3上的PR值与市售的相差不多，说明自配的培养基可以达到促鼠伤寒沙门氏菌生长。金黄色葡萄球菌在某些厂家的市售EMB上的生长率达到0.8以上，有些厂家的生长率为0或0.01，而在自配的三种培养基上均不生长，说明现市售培养基的质量参差不齐，自配培养基均可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，且抑制效果好。
　　综合结果1和结果2，EMB-1上大肠埃希菌的生长率在0.7以上，而且各菌种的生长特性与市售的更加接近，因此EMB-1配方的各成分浓度更适合，使用原料较少，培养菌株效果较好，可以节约成本，节约资源。
　　 2.3 试验菌株在自配EMB-1培养基上的颜色、菌落形态
　　为了进一步验证自配EMB-1培养基的微生物功能，我们将EMB-1和市售EMB上培养的大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028颜色、菌落形态进行对比，大肠埃希菌ATCC25922在EMB-1上的菌落大小、形状与市售EMB一致，黑色菌落，金属光泽出现时间较市售EMB晚，且与菌落浓度有关，接种量越多，金属光泽越明显。能否出现金属光泽与培养基的酸碱性密切相关，有文献报导EMB上最早观察到金属光泽的是3.3h～10h[10]。金黄色葡萄球菌 　　ATCC6538生长受到抑制，不生长或微弱生长，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028菌落无色，生长良好。
　　2.4 试验菌株在自配EMB-1培养基上的生长率测定
　　选取大肠埃希菌CMCC44829，肺炎克雷伯菌CMCC44167，沙门氏菌CMCC51105三种菌株对EMB-1的促生长能力与市售EMB培养基进行比对，结果显示，三种菌株的生长率在市售EMB和EMB-1培养基上无显著差异，其中大肠埃希菌的生长率达到0.7以上，与GB4789.28-2013[9]国标要求一致。
　　 2.5 大肠埃希菌在EMB-1和市售EMB上的生化试验比较
　　 将自配EMB-1和市售EMB平板上生长的大肠埃希菌转接到胰酪大豆胨琼脂平板上，挑取菌落制成浓度为0.5～0.7的菌悬液，使用全自动生化鉴定仪VITEK 2进行鉴定，结果发现63项生化试验结果完全一致，这个结果表明自配EMB-1培养基适合大肠埃希菌生长，其明显生化特征不变。
　　3 讨论
　　目前越来越多的人研究不同来源的蛋白胨或其替代物作为微生物生长氮源，以便节约资源，提高一些废物利用率，但绝大部分蛋白胨都是营养成分不确定的提取物[4，11-12]，可能对一些微生物生长或后续分析带来干扰。吴桂秀等人利用无机氮源和有机氮源培养标志链带藻，均能生长良好[13]。本文旨在研究一种由纯化学合成，组成成分明确的蛋白胨来替代市售EMB中的蛋白胨，以提高检测结果的准确性。
　　伊红和美蓝对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有抑制作用并且有酸碱指示剂的功能。大肠埃希菌可以分解利用培养基中的乳糖产酸，进而与伊红结合导致菌落呈现深紫色或黑色[14]。在本研究的结果1和结果3中，大肠埃希菌在纯化学合成EMB、市售EMB平板上均生长良好，菌落特征基本一致，深紫色或黑色菌落，有或无金属光泽，其生化试验结果也一致。而沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌因不能利用培养基中的乳糖，所以不产酸，在伊红美蓝培养基上菌落呈无色，这与结果1和3中的描述是一致的。GB4789.28-2013[9]要求大肠埃希菌的生长率需达到0.7以上，在EMB-1培养基上，结果2显示大肠埃希菌ATCC25922的生长率为0.92，结果4中的大肠埃希菌CMCC44829的生长率达到0.87，远远超出国标要求的0.7。说明本文中的EMB-1的促生长能力可以达到国标要求。有文章报道用EMB培养基分离纯化白色念珠菌及一些酵母菌[15-16]，因此本文中也将纯化学合成EMB上生长的白色念珠菌与市售EMB进行对比，均为白色菌落。
　　革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌浓度低时在自配培养基上不生长而在市售培养基上生长，说明其抑制作用优于某些现市售EMB。在进行大肠埃希氏菌分离鉴定时，可以消除增菌液中革兰氏阳性菌的干扰，提高检出率，增加试验准确性，为我国参考培养基体系的建立提供基础。
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