抗菌植物培养基的制备及抗菌性能研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要：通过液相还原硝酸银得到纳米银粒子，然后將其添加入植物组织培养基中，从而得到一种抗菌的复合培养基，实现植物组织的开放式培养。试验主要包括纳米银粒子的制备及复合培养基的制备。首先，采用一种绿色无毒的方法，利用果糖和葡萄糖作为还原剂还原AgNO3溶液，同时研究硝酸银浓度对纳米银粒子粒径的影响。在此基础上，制备出纳米银粒子复合的B5培养基。结果表明，随着AgNO3溶液浓度的升高，纳米银粒子的尺寸增大，粒径分布范围变宽;抗菌测试结果表明，纳米银粒子复合的B5培养基具有显著的抗菌性能。
　　关键词：植物培养基;纳米银;抗菌性能
　　中图分类号：Q-331         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）03-0079-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.015
　　Preparation of antimicrobial plant medium and research of its antibacterial properties
　　ZHANG Xin1，2，3，CHEN Jing-wen1
　　（1.Department of Chemistry and Chemical Engineering/Research Centre of New Materials，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China; 2.Engineering Research Center of Iron/Aluminum Based Nano-materials，Ankang 725000，Shaanxi，China;3.Engineering Research Center of Zinc-based Nanomaterials，Ankang 725000，Shaanxi，China）
　　Abstract： Nanosilver particles were obtained by liquid phase reduction of AgNO3， and nanosilver composite plant medium with good antimicrobial capability was successfully prepared to realize open culture of plant tissues. The experiment mainly included the preparation of nanosilver particles and the preparation of composite plant medium. First， nanosilver particles were prepared in AgNO3 solution using fructose and D-glucose as reduction reagents. The effect of AgNO3 concentration on the nanoparticle size was investigated. Second， the solvent containing the nanosilver particles was added in B5 medium to form a composite plant medium. It was found that with the increase of AgNO3 solution concentration， the average size of nanosilver particles increased， and the size distribution range became wider. Moreover， the composite B5 medium containing the nanosilver particles exhibited significant antimicrobial capability.
　　Key words： plant medium; nanosilver; antimicrobial capability
　　污染是组织培养中普遍存在的问题[1]。在植物繁殖生长过程中，接种器具、培养基灭菌不严格以及操作不规范等因素都会导致污染的发生。此外，在传统的植物组织培养过程中，植物自身携带的细菌由于难以被清除，而会被带入培养基中，引起污染。这些因素使得传统的组织培养植物生长缓慢、存活率低，抑制了植物组织培养在实际农业生产中的广泛应用与推广[1-3]。随着研究的不断深入，植物开放式培养的概念被提了出来。如果植物可以在相对开放的条件下生长，既能简化组织培养操作环节，降低生产成本，又有利于植物组织培养的工厂化、规模化发展。且在实践过程中发现，开放式组织培养对空气中的杂菌没有抵抗能力[4]，如果将抗菌剂加入到培养基中，将会使开放式组织培养具有可行性。
　　纳米银粒子具有天然的杀菌性能，对大肠杆菌、淋球菌、沙眼衣原体等数十种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，极少的纳米银就可产生强大的杀菌作用[5-7]。因此如果能将银粒子引入到植物组织培养基中，将使培养基具有抗菌功能。纳米银粒子的制备通常采用液相化学还原法，利用适当的还原剂在液相中将银盐还原而得到纳米银粒子，常用的还原剂主要有双氧水、甲醛、柠檬酸钠、水合肼、抗坏血酸、葡萄糖、果糖等[8-10]。
　　本试验将在水相体系中还原硝酸银溶液得到纳米银溶胶。室温下，利用果糖和葡萄糖为还原剂，同时研究硝酸银的浓度对纳米银粒子粒径的影响。与使用有机溶剂作为还原试剂相比，使用果糖和葡萄糖更加绿色环保，且糖可以同时作为植物培养基的能源物质。制备出的纳米银粒子被添加入B5培养基（一种铵含量较低的植物培养基）中，并测试该复合培养基的抗菌性能。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  试剂  硝酸银（AgNO3，天津市天感化工技术开发有限公司，分析纯）;果糖、葡萄糖（C6H12O6，天津市致远化学试剂有限公司，分析纯）;氢氧化钠（NaOH，天津市天力化学试剂有限公司，分析纯）;25%～28%氨水（NH3·H2O，天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯）;B5培养基（含琼脂、蔗糖，杭州木木生物技术有限公司）。
　　1.1.2  仪器  透射电子显微镜（TEM，日立H-7650）。
　　1.2  纳米银粒子复合的植物组织培养基的制备
　　1.2.1  纳米银溶胶的制备  40 ℃下，量取25 mL以上配制好的AgNO3溶液（浓度分别为1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L）于三口瓶中，加入5 mL 0.05 mol/L氨水溶液，将三口瓶置于磁力搅拌器上搅拌，溶液混合均匀后分别加入10 mL 0.15 mol/L果糖溶液、5 mL 0.01 mol/L葡萄糖溶液，接着加入几滴0.1 mol/L NaOH溶液，调节整个溶液的pH为9左右，反应1.5 h。
　　1.2.2  纳米银粒子的表征  观察纳米银溶胶体系的颜色变化，并利用透射电子显微镜观察样品的结构，进一步确定纳米银颗粒的尺寸及粒径分布情况。
　　1.2.3  纳米银粒子复合的B5培养基的制备  将3.02 g B5干粉培养基溶解于100 mL去离子水中，加热至完全溶解，然后向其中加入10 mL纳米银粒子溶胶，混合均匀，趁培养基未凝固倒入洁净的表面皿中。
　　1.3  抗菌性能测试
　　为了考察植物组织培养过程中纳米银粒子的加入是否会抑制空气中杂菌的滋生，选用新鲜草莓作为培养材料。还原浓度为1.0×10-4 mol/L AgNO3溶液得到的纳米银溶胶被添加到B5培养基中，将新鲜的草莓薄片置于复合培养基上培养，同时以未添加纳米银粒子的B5培养基作为对照。这两种培养基不经过灭菌处理直接暴露于空气中培养，观察并记录空气中杂菌的生长情况。
　　2  结果与分析
　　2.1  纳米银粒子的表征
　　反应过程中发现，伴随着反应的发生，溶液的颜色开始变化，由最初的无色透明液变为棕黄色（图1）。这是由纳米银粒子的表面等离子体共振现象引起的[11]。
　　图2是还原不同浓度的AgNO3制备出的纳米银粒子的TEM图。从图2可以看出，制备出的纳米银粒子都为不规则的球形，且分散性较好。当AgNO3浓度为1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L时，制备出的纳米银粒子的平均粒径分别为48、55、66 nm，说明随着AgNO3浓度的增加，还原出的纳米银粒子的尺寸增大。将以上3种浓度的AgNO3作对比，发现AgNO3浓度为1.0×10-2 mol/L时，制备出的纳米银粒子中出现了块状的银颗粒，且粒径分布范围较宽，在45～98 nm。
　　2.2  抗菌性能测试
　　图3展示了草莓在两种不同的B5培养基上的培养状态。第五天，未加纳米银溶胶的体系中，草莓表面及与琼脂接触的周围都有霉菌，培养基表面也有霉菌产生;相反，复合纳米银粒子的B5培养基上没有出现霉菌，只有草莓与空气接触的表面有一些零星的霉点，草莓与培养基接触的周圍也没有发霉的迹象，说明加入纳米银粒子的复合B5培养基具有显著的抗菌效果。
　　3  小结与讨论
　　本试验以AgNO3为原料，以果糖为还原剂，成功制备出不同粒径的球形纳米银粒子。结果发现，当AgNO3浓度分别为1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L时，制备出的纳米银粒子的平均粒径分别为48、55、66 nm，且伴随着AgNO3浓度的升高，纳米银粒子的尺寸增大，粒径分布范围变宽。将纳米银粒子添加到B5植物培养基中，得到的复合培养基有显著的抗菌性能。
　　参考文献：
　　[1] 方润善，候  闯.植物组织培养的研究与应用概况[J].中国高新技术企业，2010（36）：24-32.
　　[2] 周俊辉.植物快速繁殖技术中存在的问题与对策[J].仲恺农业技术学院学报，1999，12（4）：64-70.
　　[3] 朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[J].植物生理学通讯，1996，32（6）：444-449.
　　[4] 崔  刚，单文修，秦  旭，等.植物开放式组织培养研究初探[J].山东农业大学学报（自然科学版），2004，35（4）：529-533.
　　[5] SONDI I，SILVER B，SALOPEK S. Silver nanoparticles as antimicrobial agent：A case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria[J].Journal of colloid and interface science，2004，275（1）：177-182.
　　[6] ALT V，BECHERT T，STEINRUCKE P，et al. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement[J].Biomaterials，2004，25（18）：4383-4391.
　　[7] 董耀华，郭  娜，刘  涛.纳米银的制备及其抑菌机理[J].上海海事大学学报，2013，34（1）：80-83.
　　[8] 代小英，许  欣，陈昭斌.纳米银制备方法概述[J].中国消毒学杂志，2007，24（6）：561.
　　[9] 王迎春，宗彦芳，蓝  蓉.纳米银的制备及其表征[J].金属功能材料，2013，20（2）：27-30.
　　[10] 孙红刚.次磷酸钠液相化学还原法制备纳米银粉的研究[D].成都：四川大学，2005.
　　[11] VIJAYAKUMAR M，PRIYA K，NANCY F T，et al. Biosynthesis，characterisation and anti-bacterial effect of plant-mediated silver nanoparticles using Artemisia nilagirica[J].Industrial crops and products，2013，41（1）：235-240.
　　收稿日期：2019-05-15
　　基金项目：安康学院科技扶贫专项（2018FPZX01）;陕西省科技厅平台子项目（2018PT-31）;安康市重大科研攻关项目（2016AKZDCY002）
　　作者简介：张  芯（1987-），女，陕西安康人，讲师，硕士，主要从事纳米材料制备及应用研究，（电话）18291529057（电子信箱）zhangxin0621@sina.com。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/8/view-15205254.htm