不同年限苜蓿根际土壤细菌群落的多样性

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　　摘要：为研究不同年限苜蓿根际土壤细菌群落多样性及群落结构变化，选取了0、4年苜蓿的根际土壤，采用高通量基因测序技术研究其细菌构成。结果表明，4年苜蓿根际土壤中细菌分类单元（OTU）和多样性指数高于0年苜蓿，苜蓿连作会改变细菌群落数量及结构。通过主坐标分析（PCoA）及热图分析发现，不同年限苜蓿细菌群落差异性较大，连作后酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门细菌群落丰度提高，变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门细菌群落相对丰度降低。
　　关键词：苜蓿;细菌群落;细菌分类单元;多样性指数;根际土壤;主坐标分析;热图分析;序列拼接;解释度;高通量基因测序技术
　　中图分类号： S154.38+1文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）08-0184-05
　　收稿日期：2019-03-19
　　基金項目：河北省现代农业产业技术体系草业创新团队栽培与信息化管理技术岗位项目（编号：HBCT2018160202）;河北省重点研发计划-奶业振兴重大技术创新专项（编号：19226437D）。
　　作者简介：刘 震（1985—），男，河北沧州人，硕士，助理研究员，主要从事作物栽培与施肥研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：liuzhen84575151@163.com。
　　通信作者：阎旭东，硕士，研究员，主要从事作物栽培技术研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：yxd7826@126.com。
　　苜蓿（Lotus corniculatus L.）为“牧草之王”，以产量高、品质好、营养丰富和适应性好而著称[1]，在河北地区被选为“首选牧草”而被大力推广[2]。同时，由于苜蓿的根瘤菌及其残留在地下的须根系形成腐殖质可以增加土壤有机质，改善土壤团聚体结构[3]，进一步影响土壤有机碳的分解，增强土壤碳吸附作用。因此，种植苜蓿常被作为改良贫瘠干旱地区土壤的方法之一。
　　目前，苜蓿栽培的研究方向主要集中于栽培措施对苜蓿产量及品质的影响[4-7]，关于苜蓿连作后对土壤环境影响的研究较少。杨敏等研究发现，连作魔芋可以增加土壤细菌数量，减少真菌及放线菌数量，同时影响土壤蛋白酶、过氧化氢酶和脲酶活性[8]。张玥等通过对不同年限茶园进行比较发现，连作后土壤pH值显著降低，土壤中优势菌种发生变化，茶园根际土壤肥力提高[9]，说明土壤作为一个复杂的环境，其中存在的微生物及土壤酶等均参与了土壤中养分形成、发育及循环[10]。细菌群落在植物-土壤生态系统循环中扮演着重要角色[11]。但苜蓿连作后对土壤细菌群落构成的影响如何，尚须进一步研究。
　　本研究利用沧州市农林科学院苜蓿长期试验，探讨连作不同年限苜蓿根际细菌群落结构及多样性差异，探索连作苜蓿对土壤细菌群落的影响，明确苜蓿对土壤生态环境的影响，为苜蓿改良土壤、牧草产业可持续发展提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验设计及样品采集
　　试验土壤选择0年苜蓿土壤作为对照（Y0，未种植过苜蓿的土壤，重复序号为M01、M02、M03）和4年苜蓿土壤（Y4，4年生苜蓿土壤，重复序号为M04、M05、M06）作为研究对象，田间按照正常管理措施进行。
　　采样地点位于沧州市农林科学院试验基地（116.36°E、38.31°N），选择“五点法”取样。各采样点内选取生长良好的苜蓿样品，去除其周边及表层杂草后，取耕层0～20 cm苜蓿根际土壤约50 g作为1个采样点，待5个采样点全部取完后充分混匀，采用四分法选取混合均匀后土壤样品保存为1份土壤待测样品，每个处理设3次重复。将待测样品装入无菌密封袋，放入装有干冰的泡沫箱中保存。待全部样品采集完成后运回实验室，超低温冰箱-80 ℃ 保存。
　　1.2 土壤样品DNA提取及测序
　　将土壤提取基因组后采用NanoDrop-ND1000测定总DNA浓度，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA提取质量。用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）[12]和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[13]扩增细菌16S rDNA基因 V3～V4 区域，回收PCR产物并测定浓度，将不同重复间多个样品混匀。测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。
　　1.3 序列拼接及信息分析
　　使用 FLASH v1.2.7软件，通过重叠（overlap）对每个样品的碱基序列进行拼接，得到的拼接序列即原始序列数据后，再使用 Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的原始序列进行过滤，得到高质量的重叠数据，最后使用 UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效序列（effective tags）。根据得出的有效序列进行信息分析。
　　1.4 细菌群落多样性及结构分析
　　采用Chao 指数、香农指数、ACE指数、辛普森指数及覆盖度表示细菌群落物种的丰富程度及测序深度。同时利用优化后的有效序列同细菌数据库进行比对，鉴定细菌种类，确定细菌归属，并进一步比较苜蓿土壤中不同水平下细菌群落构成状况。
　　2 结果与分析
　　2.1 连作苜蓿根际土壤细菌群落基因序列数据分析
　　样品经高通量测序后，经过双端碱基序列拼接、过滤后共产生 338 043 条有效序列。对照处理获得 54 534 条平均有效序列，连作苜蓿处理获得56 349条平均有效序列，其余序列数据见表1。
　　从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的物种数目，以序列数与物种数来构建曲线。由图1可知，各样本间稀释曲线平滑，表示测序数据结果合理，M01、M02、M03稀释曲线斜率及位置低于M04、M05、M06，说明对照处理能检测出的分类单元（OTU）数量少于连作苜蓿处理，可见连作苜蓿后可以增加根际土壤中细菌群落种类。 　　2.2 连作苜蓿根际土壤细菌群落多样性指数分析
　　从表2可以看出，M01、M02、M03、M04、M05、M06的OTU分别为1 386、1 520、1 250、1 682、1 718、1 631个，整体呈现增加趋势。其他指数除辛普森指数外，ACE指数、Chao指数和香农指数趋势均与OTU趋势相同。通过表3的独立样本t检验可以看出，OTU、ACE指数和Chao指数的P值分别为0.023、0.021、0.023，各指标P值<0.05，证明连作0、4年苜蓿间上述指标存在显著差异;辛普森指数和香农指数的P值分别为0.095、0.178，2个处理间差异未达显著水平。该结果说明连作苜蓿可以增加土壤微生物的物种数量。
　　2.3 连作苜蓿根际土壤细菌群落结构分析
　　如图2所示，Y0和Y4土壤中细菌群落相对丰度>1%的均有10个，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和硝化螺旋菌门占所测细菌群落的90%以上，疣微菌门、浮霉菌门、其他、未分类和未知细菌群落所占比例较低。随着连作时间增加，酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门细菌相对丰度增加，分别提高了4.48%、6.39%、1.27%、0.91%，连作4年后变形菌门、拟杆菌門和厚壁菌门细菌低于连作0年，相对丰度分别降低了7.63%、3.13%、3.08%。
　　2.4 连作苜蓿根际土壤细菌群落PCoA分析
　　将M01、M02、M03归为Y0组，M04、M05、M06归为Y4组。由图3可以看出，采用weighted-unifrac算法经过主坐标分析（PCoA）分析可以解释PC1和PC2共87.24%的样品信息。Y0处理主要分布于PC1的0值及PC2正端区域附近，Y4处理位于PC1的正端及PC2的负端区域，2个样品分组间相似性较小，差异显著，细菌群落谱系间存在差异。说明连作后苜蓿根际土壤间微生物群落物种发生改变。
　　2.5 连作苜蓿根际土壤细菌群落热图
　　根据16S rDNA序列构建热图，结果如图4所示，连作0年苜蓿土壤中细菌群落相对丰度较高（平均值大于0.01）的是酸杆菌、放线菌、拟杆菌、绿弯菌、厚壁菌、芽单胞菌、硝化螺旋菌、浮霉菌、变形菌和疣孢菌;连作4年苜蓿土壤中酸杆菌、放线菌、拟杆菌、绿弯菌、厚壁菌、芽单胞菌、硝化螺旋菌、浮霉菌、变形菌、糖杆菌和疣孢菌丰度较高。
　　3 讨论
　　细菌多样性指数对细菌群落变化有一定的指示作用，不同群落结构的多样性指数差异性不同。如稀释性曲线是通过随机抽取序列并与物种数来构建曲线，反映样品中物种OTU的丰富程度[14]，其他指数也有类似功能，可以用来衡量物种丰度及物种多样性[15]。复杂的细菌群落结构可以增加土壤抵抗环境逆境的能力，对保护土壤生态环境有重要意义[16]。本研究发现，测序数量<15 000条时，各样品内细菌群落种类均迅速增加，有大量不同细菌群落被发现;当测序数量>15 000条时，连作0年苜蓿处理根际土壤内细菌群落种类趋于稳定，连作4年苜蓿处理细菌群落种类继续增加，直至测序数量达30 000条时趋于稳定。连作苜蓿后土壤根际细菌群落OTU数量及物种丰度指数显著提高（P<0.05）。
　　土壤细菌数量巨大，不仅参与土壤养分元素的转化，同时还参与土壤团粒结构的形成和变化等过程，因此细菌对土壤可持续利用有至关重要的作用[17]。不同的细菌群落构成对土壤养分循环存在差异性，徐丽君等研究发现，4年生苜蓿可以显著提高土壤有机质、全量及速效（N、P、K）养分含量[18]。主成分分析结果显示，不同连作年限间苜蓿细菌谱系间距离较远，分析连作后细菌群落构成发现酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门细菌群落在根际土壤中相对丰度增加，可以增加土壤抗逆境能力。如放线菌可以通过产生硝吡咯菌素、2，4-二乙酰基间苯三酚和吩嗪2-羧酸等抗生素类物质，对土传病原菌产生拮抗作用[10]。变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门等细菌群落丰度降低，变形菌是根际土壤中的优势菌种。本研究结果同张红娟等的研究结论[19-20]相似，说明连作苜蓿可以对土壤细菌群组成产生影响，改变其中某些细菌的所占比例，不同连作年限间细菌功能存在差异性。
　　4 结论
　　通过对不同年限间苜蓿根际土壤微生物细菌群落分析发现，其细菌多样性指数及群落结构组成均发生改变，多年种植苜蓿可以提高根际土壤中微生物OTU种类，同时期优势细菌数量及群落结构也会发生改变，放线菌门细菌数量的增加可以起到改良土壤、提高土壤抗逆性的功能。这些结果都说明连作苜蓿会对土壤生态环境产生影响。由此可以推断，苜蓿改良土壤的功能除物理结构发生变化外，细菌群落结构的变化也可能是原因之一。
　　本研究利用高通量基因测序技术分析了不同连作年限苜蓿根际土壤细菌群落的多样性及结构差异性，但对具体细菌群落的功能未作探讨，同时未能明确连作年限对苜蓿根际土壤细菌群落结构产生差异的原因和影响机制，这些问题还须要在后续的工作中开展进一步研究。
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