解淀粉芽孢杆菌TF28对设施连作黄瓜根际土壤酶活性和微生物的调节

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　　 摘要：为研究解淀粉芽孢杆菌TF28对设施连作黄瓜根际土壤环境影响，以液体（L）、颗粒（P）和复合（LP）3种处理与没有施用TF28的空白对照进行对比试验，测定设施黄瓜生育指标、土壤酶活性及微生物种群数量。结果表明，移栽后2～3周后L、P和LP 3种处理株高分别提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2种处理对黄瓜根须数量与空白对照相比分别提高35.20%和48.66%。移栽2～8周，与空白对照相比，P处理对碱性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性高69.43%、77.43%，L处理脲酶活性提高40.99%，LP处理过氧化氢酶活性提高163.24%。与空白对照相比，3种处理都能显著增加土壤细菌和放线菌数量，降低真菌数量。这说明TF28的添加对连作黄瓜中的酶活性、微生物数量及群落结构有明显的调节作用。
　　 关键词：黄瓜;连作障碍;土壤理化性质;解淀粉芽孢杆菌细菌;微生物;调节作用
　　 中图分类号： S182 文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2020）07-0152-05
　　 随着我国设施农业的不断发展，连作障碍越来越突出[1]。黄瓜作为设施蔬菜主要品种，近年来其连作障碍的发生机制及其防治措施受到学者们较广泛的关注，已有的研究表明，土壤微生物区系失衡是黄瓜连作障碍发生的主要原因之一[2]，且施用有机肥及微生物肥可有效改善土壤微生物生态环境，能有效解除作物连作障碍[3]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布广泛，是一类重要的生防资源菌，也是具有较高开发价值的农用微生物[4-6]，在植物病害生物防治方面具有广阔的应用前景[7]。内生解淀粉芽孢杆菌TF28是从大豆根部分离出的1株内生细菌，具有广谱抗菌活性[8]，前期研究发现对番茄具有抗病作用，并对生长具有调控作用，同时能提高果实品质[9]。
　　笔者对菌株TF28以液体（L）、颗粒（P）和复合（LP）3种处理方法与空白对照（CK）进行对比试验，研究其对棚室连作黄瓜的生长发育、土壤菌群和根迹微生态酶活的变化，找到可以改善棚室连作土壤质量和环境的菌株和方法，从而更有利于设施农业健康发展，实现设施蔬菜生产能力的持续稳定健康发展。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验设计
　　内生解淀粉芽孢杆菌TF28由黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江省生物工程重点实验室分离保存。本试验地点在黑龙江省哈尔滨市太平镇兴业村，于2018年2月23日穴盘育苗，4月5日移载到温室大棚中;黄瓜品种为“早熟绿神”，种子购于哈尔滨全福种苗有限公司。试验颗粒为腐殖酸颗粒;细菌NYD培养基（货号BS1002）;PDA培养基（北京陆桥技术股份有限公司）;放线菌培养基（货号BS1075）。将解淀粉芽孢杆菌TF28制成浓度为108 CFU/mL的菌悬液，置于4 ℃冰箱中待用。试验用颗粒剂制备：将菌悬液用喷壶均匀地喷涂在腐殖酸颗粒上，制成含菌量为2亿～3亿CFU/g的颗粒剂，常温保存备用。
　　施菌剂方法：（1）液体处理（L），108 CFU/mL菌悬液5 mL浇在苗根部;（2）颗粒剂施肥法（P），移栽时将颗粒剂（2亿～3亿CFU/g）按5 g/株均匀撒在垄沟，再将瓜苗栽上;（3）复合施用法（LP），瓜苗移栽时，苗根部均匀放置5 g/株颗粒剂（2亿～3亿CFU/g），将瓜苗栽上后再浇灌5 mL菌悬液（108 CFU/mL）;以清水处理为空白对照。移植第1周和第2周，随机选取健壮的黄瓜，对株高、叶面积（根部起测量第5张叶片）、根须数量、主根长度和根部干质量等生育指标进行测定，3个重复，每个重复5株;黄瓜果实在移栽第5周测定，共取样3次，每次取1空（72株/空）成熟果实，黄瓜移栽至大棚后每周取1次土样，采用5点取样法取样，将每个处理5点的土壤样品混合为1个重复，过2 mm筛，-80 ℃ 冻存备用。
　　1.2 测定仪器与方法
　　离心机AIGMA 3-18K（日本）;紫外分光光度计INESA-UV757CRT（青岛聚创环保设备有限公司），96孔板Costar 3590，石英比色皿0.35 mL（型号为YA1150，Solarbio北京）。葉面积采用叶面积测量仪YMJ-B（浙江托普仪器有限公司）测量;土壤pH值采用FILDSCOUT pH400 Meter 2109仪读取;碱性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性检测试剂盒Solarbio（货号BC0285）、土壤酸性磷酸酶（S-ACP）试剂盒Solarbio（货号BC0145）、土壤脲酶（S-UE）活性检测试剂盒Solarbio（货号BC0125）、土壤过氧化氢酶（S-CAT）活性检测试剂盒Solarbio（货号BC0105），4种酶活性测定按规程进行操作，其中脲酶活性测试中37 ℃水浴锅用37 ℃恒温培养箱代替。
　　1.3 数据分析
　　采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析，应用ANOVA单因素（LSD法）进行显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 TF28对黄瓜生育指标和土壤理化性质的调节作用
　　施用TF28菌剂2～3周后对黄瓜的叶片、根部采用5点取样法进行对比，结果（表1）表明，P、LP、L 3种处理株高与空白对照相比分别提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2种处理根须数量分别高于空白对照35.20%和48.66%;3种处理对叶面积、果实质量、根长和根质量影响不显著。
　　 由图1可见，L处理的pH值为7.35～5.12，移栽后1周最高，7周最低;LP处理的pH值为6.58～5.85，6周最高，5周最低;P处理的pH值6.34～5.23，1周最高，6周最低;CK处理pH值较平稳，在6.18～5.23之间，1周最高，5周最低。 　　2.2 TF28对连作黄瓜土壤酶活性的影响
　　由图2-A可见，3种处理对连作黄瓜根际碱性磷酸酶活性具有调节作用。在移栽后3周，L、P和LP处理的碱性磷酸酶活性都高于CK，其中L处理与CK差异明显，提高了23.11%;在移栽后6周，L和LP 2种处理的碱性磷酸酶活性呈下降趋势，P处理呈上升趋势，与CK差异明显，提高35.03%;在移栽后7周，LP处理的碱性磷酸酶活性高于CK 24.19%， [CM（17*2]其他2种处理趋于空白对照。 由图2-B可见，3种处理酸性磷酸酶活性在移栽后2周均提高，L和CK处理差异明显，提高14.33%;移栽后3周3种处理都高于空白对照，分别提高41.47%、22.20%和77.43%;移栽后4周3种处理仍高于空白对照，其中L处理明显高于CK，较CK提高17.91%。由图2-C 可见，L处理的脲酶活性在移栽后4周明显高于CK 24.34%。由图2-D可见，L、LP和P 3种处理过氧化氢酶活性都明显高于CK，分别提高158.70%、163.24%和138.97%;移栽后6周LP处理明显高于CK 86.15%;移栽后7周L处理明显高于CK 102.36%;移栽后8周3种处理都明显高于CK，分别提高83.20%、91.52%和119.62%。
　　2.3 菌株TF28对黄瓜根际土壤微生物数量的影响
　　施用TF28菌剂的3个处理对棚室连作黄瓜土壤中细菌、真菌和放线菌具有调节作用，提高细菌和放线菌的数量，降低了真菌的数量。由表2可见，移栽后L处理的黄瓜根际土壤细菌数量从移栽后1～8 周分别比CK增加368.35%、279.21%、256.90%、134.54%、263.43%、90.35%、9.95%和-4.51%;LP处理黄瓜根际土壤细菌分别比CK增加367.57%、378.22%、357.66%、186.91%、254.73%、17.95%、5.30%、-21.83%;P处理黄瓜根际土壤细菌分别比CK增加271.07%、355.05%、252.36%、187.22%、237.85%、64.86%、26.32%和-0.58%。
　　由表3可见，移栽后L处理的黄瓜根际土壤放线菌数量从移栽后1～8周分别比CK增加125.16%、146.56%、141.14%、123.21%、131.75%、125.79%、69.18%和46.36%;LP處理放线菌数量分别比CK增加52.20%、78.63%、56.96%、125.00%、89.95%、49.69%、64.15% 和30.46%;P处理放线菌数量分别比CK增加159.12%、222.90%、223.42%、215.48%、207.41%、251.57%、45.28%和68.87%。
　　由表4可见，移栽后L处理的黄瓜根际土壤真菌数量从移栽后1～8周分别比CK降低69.72%、51.52%、46.01%、39.34%、43.41%、35.34%、21.60%和30.29%;LP处理真菌数量分别比CK降低23.85%、41.21%、47.79%、65.57%、77.52%、81.95%、70.04%、65.14%;P处理真菌数量分别比CK降低51.38%、70.91%、70.99%、84.43%、72.87%、63.16%、24.80%和23.43%。
　　3 讨论
　　植物根际是植物与外界环境交流的主要场所，土壤中微生物的含量与生态系统功能的发挥密切相关，是土壤中有机质养分的一种短暂而最有效的贮存形式[10-11]，同时也是土壤肥力水平的活指标[12]。内生细菌具有在植物体内定殖传导，不易受外界环境影响等优点，解淀粉芽孢杆菌TF28是广谱生防菌株，有研究表明接种TF28后能够提高番茄抗灰霉病能力，番茄叶片防御酶活性及JA（茉莉酸）和SA（水杨酸）含量升高[9]，本试验对TF28以液体、颗粒剂和复合3种形式施用，可以提高棚室连作黄瓜苗期株高和根须数量，显著提高设施黄瓜土壤中细菌和放线菌的数量，降低真菌数量，其中以颗粒形式施用比其他2种处理效果要好。说明TF28可以改善棚室连作黄瓜土壤质量和环境，对土壤具有调节作用，利于植株生长发育，可以抑制由于连作引起的由“细菌型”向“真菌型”转变。已有研究表明，不同作物的根际有其特定的微生物群落，就是同一作物在不同生育时期和营养状态下，其根际微生物数量也呈现一定的动态变化[13]。微生物数量及多样性的增加，作用期较短，这与张昕等研究2株生防菌对黄瓜根围的环境生态效应结果[14]相似，生防菌株的施入对土壤中细菌的种群数量有短期影响，但随着黄瓜生育期的延长，施入生防细菌土壤的细菌数量最终与对照土壤中细菌数量持平。其原因可能是土壤本身的微生物生态环境有一定的自我恢复能力，在受到外来因素扰动后，短期内出现激烈的变化，但是随着时间的推移逐步恢复到原有的水平。
　　土壤酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一[15]，酶活性反映土壤物质能量代谢强度[16]。设施蔬菜连作会导致土壤酶活性降低、微生物群落结构单一化、有害微生物数量增多[17-21]。土壤磷酸酶活性可以用来评价土壤磷素状况[18]，磷酸酶酶促作用能加快土壤有机磷的脱磷速度;碱性磷酸酶作为一种适应酶，当植物缺少磷肥时碱性磷酸酶会增加，其活性会随着磷素含量的上升而降低[19]。土壤磷酸酶活性与作物的生育期和土壤水分含量、土壤温度、土壤pH值等多方面因素有关[20-21]。本研究中3种处理均提高了碱性磷酸酶、酸性磷酸酶。在移栽后8周内，所有样品除了第1周L处理呈碱性，其他样品都在酸性范围内，酸性磷酸酶活性L处理在第2周最高，为37 407.71 nmol/（g·d），碱性磷酸酶活性P处理在第6周达到最高值25 684.77 nmol/（g·d），3种处理无论是单个样品还是8周平均数值，酸性磷酸酶作为优势酶作用要大于碱性磷酸酶，在苗期酸性磷酸酶呈先升高再降低的趋势，与战厚强等的研究结果[22]相同。脲酶是催化尿素水解的唯一酶，可以将酰胺态有机氮化物水解转化为植物可直接利用的无机氮的酶，脲酶活性可以反映出土壤供氮水平和能力[23]。本试验结果显示，L、LP处理脲酶活性在苗期移栽后3、4周与对照差异显著，说明TF28可以改善棚室连作土壤供氮水平。土壤中的过氧化氢酶活性能够反映土壤中碳、氮物质的转化情况[24]。已有研究表明，生物炭的添加对设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物具有调节作用[25]。本试验中L和LP 2种处理的过氧化氢酶活性在移栽后6、7周达到最高值，说明TF28对碳、氮转化具有促进作用。 　　從移栽后连续8周对4种酶活性进行测试，结果显示，酸性磷酸酶活性在移栽后2周出现最高值，脲酶活性在移栽后3、4周出现最高值，碱性磷酸酶活性在移栽后6周出现最高值，过氧化氢酶活性的最高值出现在移栽后7周，4种酶活性达到最高值的时间有先后顺序，依次是酸性磷酸酶、脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶，这些活性变化还须要进一步研究其代谢功能来验证说明。3种处理中P处理能明显提高碱性磷酸酶，L处理能明显提高酸性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶。
　　4 结论
　　解淀粉芽孢杆菌TF28对设施连作黄瓜根际土壤酶活性、微生物含量和pH值具有调节作用，3种处理中L和P 2种处理效果明显，可以提高苗期植株株高、苗期根须数量以及土壤中的碱性磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性，酸性磷酸酶是主导磷酸酶。施用TF28可提高土壤细菌和放线菌数量，降低真菌数量。8周连续采样结果显示，无论是菌群数量、pH值、4种酶活性都呈波浪状起伏，说明土壤自身调节能力，TF28可以促进土壤自身恢复调节。
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