菊迪基氏菌生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM抑菌物质防治效果评价及药剂筛选

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　　摘要：采用單因素试验方法优化生防菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）D2WM抑菌物质的提取效率，并对抑菌物质粗提取的储藏特性展开研究，同时利用市售药剂对菊迪基氏菌（Dickeya chrysanthemi）进行室内药剂筛选，对比生防菌剂与市售药剂的防治效果。结果表明，通过单因素优化提取生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM中的抑菌物质，发现最佳提取溶剂为正丁醇，有机溶剂与发酵液体积比为1∶7、提取时间为0.5 h;抑菌物质具有良好的热稳定性和紫外光照稳定性，在处理温度达100 ℃，紫外光照射12 h时，抑菌效果均没有显著性下降，抑菌圈仍有23 mm;当抑菌物质储存180 d后，抑菌圈大小仍有16.33 mm。生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物对黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、菊迪基氏菌、丁香假单胞菌和黄单胞菌等植物病原菌均有良好的抑菌效果。测定的19种药剂中对菊迪基氏菌有良好抑制作用的仅有新田秀才6号、中生菌素、噻霉酮和氯溴异氰尿酸4种;其中，以生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物作为对照药剂，发现其抑菌效果高于噻霉酮和氯溴异氰尿酸。
　　关键词：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）D2WM;抑菌物质;抑菌效果;药剂筛选
　　中图分类号：S476         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）02-0087-06
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.018           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Evaluation of the control effect of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens
　　D2WM on Dickeya chrysanthemi and its fungicides screening
　　CHEN Jia-min1，2，LIU Hui-ying1，2，ZHANG Xiang-hui1，DENG Ting-ting1，WEI Mi1
　　（1.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables/College of Life Science and Technology，Hubei Engineering University，Xiaogan 432000，Hubei，China;2.College of Life Science，Hubei University，Wuhan 430062，China）
　　Abstract： Single factor test was used to optimize the extraction efficiency of Bacillus amyloliquefaciens D2WM antimicrobial substance， and the storage characteristics of crude extraction of antimicrobial substance were studied. The stability of crude extracts and the fungicides screening on Dickeya chrysanthemi were studied. The results of biocontrol agents and commercial agents were compared. The results indicated that the optimum extraction solvent was n-butyl alcohol， the volume ratio of organic solvent to fermentation broth was 1∶7， and the extracting time was 0.5 h. In addition， the antimicrobial substances showed excellent stability towards temperature and ultraviolet. The antimicrobial activity was not influenced when exposed at 100 ℃， or after treatment of ultraviolet irradiation for 12 hours， the size of the antimicrobial circle was still 23 mm. When the antimicrobial substances were stored for 180 days， the size of the antimicrobial circle was still 16.33 mm. The crude extracts of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens D2WM had good bacteriostatic effects on plant pathogens such as Pectobacterium atrosepticum， Pectobacterium carotovorum， Dickeya chrysanthemi， Pseudomonas syringae and Xanthomonas arboricola. Only New-tian Xiucai No. 6， Zhongshengmycin， benziothiazolinone and chloroisobromine cyanuric acid had good inhibitory effects on Dickeya chrysanthemi among the 19 tested medicines. It was found that the bacteriostatic effect of crude extract of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens D2WM was higher than benziothiazolinone and chloroisobromine cyanuric acid. 　　Key words： Bacillus amyloliquefaciens D2WM; antibacterial substances; antagonism effect; fungicides screening
　　菊迪基氏菌（Dickeya chrysanthemi）是一种引起软腐病的革兰氏阴性（G-）植物病原菌，属于迪基氏菌属（Dickeya）。该属的寄主极为广泛，包括各种农作物、果树和观赏植物等，如香蕉[1]、玉米[2]、甘薯[3]、菊花属、石竹类属、马铃薯、番茄、梨树[4，5]等，在世界范围内都会造成经济产量和品质的严重损失。其中，化学杀菌剂具有广谱、高效、快速等特点，在防治植物病害和保证作物产量方面有显著作用，但不合理使用化学杀菌剂，会引起一系列的环境和社会问题[6]。而生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法之一[7]，能够有效兼治植物病害和环境污染等问题。因此，利用生防菌所产的抑菌物质防治植物病害成为目前国内外研究热点，相关的微生物菌剂也不断涌现[8]。有研究表明，能够拮抗细菌性软腐病的生物防治药物主要是芽孢杆菌[9]。如杀菌剂Serenade TM和Sonata AS，其有效菌株是枯草芽孢杆菌QST 713和QST 2808[10]。2013年登记的Taegro，其有效菌株是解淀粉枯草芽孢杆菌变种Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens菌株FZB24;以及2015年，以一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为成分的生物肥料Rhizo Vital42[11]。由于以生防菌中有效抑菌成分所制得的生物防治药物在实际应用上会受到环境中土壤温度、光照和土壤生态系统等因素的影响，致使防治效果降低或不稳定[12]。因此，得到1株生防效果显著、抑菌物质稳定的生防菌具有重要意义。
　　筛选到的1株对菊迪基氏菌病菌有很好抑制作用的生防菌株解淀粉芽孢杆菌D2WM，采用单因素试验方法优化其抑菌物质的提取效率，并对粗提取抑菌物质的稳定性、广谱性和抑菌效果进行较全面的评价，同时利用市售药剂对菊迪基氏菌进行室内药剂筛选，对比生防菌剂与市售药剂的防治效果，为菊迪基氏菌综合防治措施提供一定的理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  供试菌株  蔬菜软腐病菌菊迪基氏菌HUEU-9、生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM、黑腐果胶杆菌（Pectobacterium atrosepticum）、胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）和黄单胞菌（Xanthomonas arboricola）由湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室提供。
　　1.1.2  供试药剂及其他化合物  供试药剂为市售常用农药，如表1所示。氯化钠（AR）购于天津市凯通化学试剂有限公司;蛋白胨（BR）购于生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母粉（FMB）购于生工生物工程（上海）股份有限公司;正丁醇（AR）购于天津市富宇精细化工有限公司分析纯。
　　1.1.3  供试培养基  LB液体培养基：氯化钠10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。
　　LB固体培养基：在上述LB液体培养基中加入18.0 g琼脂。
　　1.1.4  仪器与设备  电子天平（JA2003C），上海越平科学仪器有限公司;恒温摇床（TS-200B），上海天呈实验仪器制造有限公司;隔水式恒温培养箱（2HP-9050），上海索谱仪器有限公司;高速台式离心机（GT10-1T），北京时代北利离心机有限公司;双人单面净化工作台（SW-CJ-2D），苏州净化设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌器（LX-C75L），合肥华泰医疗设备有限公司;752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。
　　1.2  方法
　　1.2.1  生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物提取方案的优化  将新鲜的解淀粉芽孢杆菌D2WM按1%的接种量接入灭菌的200 mL LB液体培养基中，30 ℃，180 r/min培养18 h后，将发酵液10 000 r/min离心5 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，得无菌滤液。
　　1）有机溶剂的优化。按照极性由低到高，分别选取石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇作为萃取溶剂，按1∶1（无菌滤液：有机溶剂）比例放入三角瓶中振荡混匀1 h后于分液漏斗静置，取有机相用旋转蒸发仪抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法测定最优抑菌效果。
　　2）有机溶剂萃取比例优化。将最佳有机溶剂和无菌滤液比例分别按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9放入三角瓶中，振荡混匀1 h后于分液漏斗静置，取有机相用旋转蒸发仪抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法測定最优抑菌效果。
　　3）有机溶剂萃取时间优化。将最佳有机溶剂和无菌滤液按最佳比例放入三角瓶中，混匀分别振荡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h后于分液漏斗静置，取有机相用旋转蒸发仪抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法测定最优抑菌效果。
　　1.2.2  生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物的稳定性评价  根据畅涛等[13]检测抑菌物质稳定性的方法，略作改动，设置温度、紫外光和储藏时间3个因子来检测解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物的稳定性。
　　1）温度的影响。将生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物分别在40、50、60、70、80、90、100、121 ℃下处理40 min后，采用抑菌圈法测定抑菌效果。 　　2）紫外光的影响。将生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物在紫外光下分别照射2、4、6、8、10、12 h后，采用抑菌圈法测定抑菌效果。
　　3）储藏时间的影响。将生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物在4 ℃冰箱分别存放30、60、90、120、150、180 d，采用抑菌圈法测定抑菌效果。
　　1.2.3  生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM抑菌效果评价  将5种病原细菌（黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、菊迪基氏菌、丁香假单胞菌和黄单胞菌）分别于LB液体培养基培养至对数期，取20 μL病原细菌于LB固体培养基涂布，用抑菌圈法检测不同浓度生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物抑菌效果。
　　1.2.4  试验药剂初筛  将19种供试药剂用无菌水稀释10倍作为母液，取新鲜病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9 20 μL于LB固体平板上涂布，用无菌打孔器均匀打3个孔，即3次重复，每孔加入20 μL供试药剂母液，以无菌水为对照。观察是否有抑菌圈出现，以确定室内毒力测定的待测药剂。
　　1.2.5  试验药剂的室内毒力测定  采用抑菌圈法将初筛结果中抑制病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9效果最好的药剂进行毒力测定，以解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物作为对照药剂，将各试验药剂配成不同浓度梯度。在含菌的LB固体平板上均匀打3个孔，将药剂加入孔中，市售药剂以无菌水作对照，粗提物以甲醇为对照，放入30 ℃培养至出现明显抑菌圈后。用十字交叉法测定抑菌直径。以解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物为对照药剂，比较其与各试验药剂的抑菌效果。按以下公式[14]计算试验药剂对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9生长的抑制率。
　　抑菌率=（处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径×100%
　　將抑制率转换为几率值[15]，求出供试药剂浓度的对数值，建立毒力回归方程式[16]，求出有效中浓度（EC50）。
　　2  结果与分析
　　2.1  生防菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM粗提物提取方法优化
　　由图1可以看出，4种有机溶剂萃取所得粗提物对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9均有一定抑菌作用，且按照有机溶剂极性从低到高的顺序抑菌作用越来越强，而正丁醇萃取后抑菌圈大且清晰。说明提取解淀粉芽孢杆菌D2WM抑菌物质的最佳萃取溶剂为正丁醇。
　　由图2可以看出，不同萃取比例提取所得粗提物对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9抑菌作用差异不显著，而有机溶剂与无菌滤液萃取比例为1∶7时，抑菌圈最大，为23.5 mm;说明提取解淀粉芽孢杆菌D2WM抑菌物质的最佳萃取比例为1∶7（有机溶剂∶无菌滤液）。
　　由图3可以看出，当萃取时间为0.50 h时，提取所得粗提物对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9抑菌效果最好，说明提取解淀粉芽孢杆菌D2WM拮抗物质的最佳萃取时间为0.50 h，抑菌圈最大，为23.6 mm。
　　2.2  生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM的稳定性评价
　　由图4可知，当处理温度低于100 ℃时，生防菌粗提物的抑菌效果没有显著性差异，说明解淀粉芽孢杆菌D2WM产生的抑菌物质在100 ℃以下具有较好稳定性;当处理温度达到100 ℃时，抑菌效果才开始显著下降。由图5可知，紫外光照射12 h内对生防菌粗提物的抑菌效果没有显著性影响，说明解淀粉芽孢杆菌D2WM产生的抑菌物质在紫外光照射下具有较好稳定性。由图6可知，当储存60 d后抑菌效果开始降低，随着储藏时间的延长，抑菌效果呈缓慢下降趋势，在180 d时，抑菌圈大小为16.33 mm。畅涛等[13]也发现，芽孢杆菌B-401所产抑菌物质在温度为25～90 ℃、紫外光照射6 h时均有较好稳定性，与本研究结果一致。
　　2.3  生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物的抑菌效果评价
　　由表2可知，生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物对病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、菊迪基氏菌、丁香假单胞菌、黄单胞菌均有抑菌效果，随着浓度的减小抑菌效果除黑腐果胶杆菌外，均显著降低。其中，对病原菌丁香假单胞菌抑菌效果最好，抑菌率达71.66%;对病原菌黑腐果胶杆菌抑菌效果最差。
　　2.4  试验药剂初筛
　　采用抑菌圈法对19种市场上常用杀菌剂进行初筛，确定室内毒力待测药剂。由表3可知，对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9有抑菌效果的有噻霉酮、氯溴异氰尿酸、中生菌素和新田秀才6号，抑菌圈直径分别为23.0、10.5、15.0、16.5 mm，其余15种杀菌剂对病菌无抑菌作用。
　　2.5  试验药剂的室内毒力测定
　　由表4可知，供试的4种市售杀菌剂对病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9的生长都有抑制作用。其中，杀菌剂80%新田秀才6号EC50最低，为0.036 0 mg/mL，抑菌效果最好;其次是12%中生菌素和3%噻霉酮，EC50分别为0.237 6 mg/mL和0.564 5 mg/mL，抑菌效果较好;最后是50%氯溴异氰尿酸，EC50为2.057 2 mg/mL，在供试的4种杀菌剂中抑菌效果较差。其中，以生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物作为对照药剂，发现其抑菌效果高于3%噻霉酮和50%氯溴异氰尿酸，为0.302 5 mg/mL。
　　3  小结与讨论
　　结合抑菌物质的成熟提取方法，本试验通过单因素初步优化提取生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM中的抑菌物质，发现最佳提取溶剂为正丁醇，有机溶剂与无菌滤液萃取比例为1∶7，提取时间为0.5 h，该优化方法可显著减少生产成本的投入。目前，对生防菌中抑菌物质的提取方法优化还未见报道。且通过抑菌圈法发现初步优化提取所得生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM的抑菌物质具有良好的热稳定性和紫外光照稳定性，在温度低于100 ℃时，抑菌效果没有显著性下降，在紫外光照射12 h后抑菌效果也没有显著性影响，当抑菌物质储存180 d后，抑菌圈大小仍有16.33 mm，而李占杰等[17]筛选到生防菌株CAB-1的抑菌物质在60 ℃及其以下具有热稳定性，紫外光照射50 min后其活性显著降低;张华等[18]筛选到生防菌株B10-26的抑菌物质活性也随着温度的升高有所下降。李威等[19]筛选到生防菌株在4 ℃条件下贮藏28 d后抑菌活性开始显著下降。由此说明，生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM的抑菌物质稳定性优于已报道的部分生防菌。此外，该生防菌对5种（黑腐果胶杆菌ZBX-2、胡萝卜软腐果胶杆菌ZX-1、菊迪基氏菌HUEU-9、丁香假单胞菌G1和黄单胞菌DW3F3）排名前十的植物病原细菌[20]均有不同程度的防治作用，可以解决大田内多种病原菌同时存在的问题。测定的19种市售杀菌剂中对菊迪基氏菌有良好抑制作用的仅有4种，其中，生防菌株抑菌物质作为对照药剂的抑菌效果还高于3%噻霉酮和50%氯溴异氰尿酸。说明该生防菌防治病害效果不比化学杀菌剂差，具有市场应用前景和价值。 　　参考文献：
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　　收稿日期：2019-03-28
　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（31600055）;中国博士后项目（2018M642815）
　　作者简介：陈嘉敏（1995-），女，湖北孝感人，在读硕士研究生，研究方向为作物学，（电话）13733427825（电子信箱）1002359952@qq.com;
　　通信作者，魏  蜜（1987-），女，湖北孝感人，副教授，博士，主要从事微生物学和植物病害生物防治，（电子信箱）weimi555@163.com。
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