解钾菌ZMD02的解钾活性及生长特性研究

来源:用户上传      作者:吴俊林 郭传滨 贾真 郝浩浩 许晓敬 杨立均 孙会忠

　　摘要 采用火焰分光光度法對从烟草根际土壤中分离到细菌ZMD02的解钾活性进行了测定，结果表明，在28 ℃、180 r/min条件下发酵培养7 d后，菌株ZMD02发酵液中水溶性速效钾含量达1.5 μg/mL，故将ZMD02定性为硅酸盐菌株。对ZMD02的生长特性研究表明，ZMD02对不同糖源的发酵产气能力表现为葡萄糖>麦芽糖>乳糖>直链淀粉>支链淀粉;对碳同化能力表现为麦芽糖>葡萄糖>乳糖>直链淀粉>支链淀粉;ZMD02对不同氮源的同化能力表现为酵母膏>蛋白胨>硫酸铵>硝酸钾>尿素;ZMD02的最适生长温度为30 ℃，最适pH为7。ZMD02菌株可作为烟草生物钾肥开发的备用菌株。
　　关键词 烟草;解钾菌;生长特性
　　中图分类号 S572文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0170-02
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.048
　　Potassium Dissolving Activity and Growth Characteristics of Silicate Bacteria ZMD02
　　WU Junlin，GUO Chuanbin，JIA Zhen et al
　　（Zhumadian Branch of Henan Provincial Tobacco Company，Zhumadian， Henan 463000）
　　Abstract The potassium activity of bacteria ZMD02 isolated from tobacco rhizosphere soil was determined by flame spectrophotometry. The results showed that after 7 days of fermentation at 28 ℃ and 180 r/min， the content of watersoluble rapidly available potassium in ZMD02 fermentation broth reached 1.5 μg/mL. Therefore， ZMD02 was characterized as silicate strain. The growth characteristics of ZMD02 showed that the order of fermentation capacity of ZMD02 to different sugar sources was glucose > maltose > lactose > amylose > amylose. The order of carbon assimilation ability was maltose > glucose > lactose > amylose > amylose. The order of assimilation ability of ZMD02 to different nitrogen sources was yeast extract > peptone > ammonium sulfate > nitrate > urea. The optimum growth temperature of ZMD02 was 30 ℃ and the optimum pH was 7. ZMD02 strain could be used as an alternative strain for the development of biopotash fertilizer in tobacco. 　　Key words Tobacco;Silicate bacteria;Growth characteristics
　　基金项目 河南省烟草公司驻马店市公司项目“植烟土壤的微生物定向调控保育技术研究”;河南省高等学校重点科研项目（16A180003）。
　　作者简介 吴俊林（1986—），男，河南驻马店人，助理农艺师，从事烟叶生产与管理研究。
　　收稿日期 2019-10-02
　　钾不是生物细胞的结构成分，但钾素具有维持细胞结构、保持细胞的渗透压、吸收养分和构成酶的辅酶等生理功能，由于钾易被植物秸秆、果实、籽粒等形式带走，土壤作为一个天然钾库，90%～98%的钾存在于硅酸盐矿物质中，植物并不能直接吸收利用[1-3]。因此，必须不断补充钾才能满足植物生长发育的需要，尤其对于嗜钾作物烟草而言，补充钾素显得尤为重要[4-6]。解钾菌（silicate bacterium）是一类可以分解硅酸盐矿物的细菌，也称为硅酸盐细菌，它能够使矿物中的钾分解为植物科吸收利用的有效钾[7-9]。随着烟草有机（绿色）生产发展理念的提倡和推广，生物钾肥在烟草产量提高和品质改善方面的作用越来越受到重视，在此大背景下，分离筛选野生解钾菌菌种资源具有极强的理论价值和应用潜力。笔者从烟草根际土壤分离到一株细菌，编号为ZMD02，对其解钾活性及其生长特性进行研究，以期为该菌株的诱变育种、生物钾肥开发等下游研究奠定理论基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　解钾菌ZMD02：分离于烟草的根际土壤，保存于驻马店市烟草公司生产技术中心实验室。
　　解钾菌发酵培养基：按100 g培养基计，分别含有钾长石0.30 g（超纯水水洗5次），磷酸氢二钠0.20 g，碳酸钙0.01 g，七水硫酸镁0.5 mg，三氯化铁0.5 mg，蔗糖0.50 g，海藻糖0.10 g，琼脂粉1.80 g，pH控制在7.0～7.5。
　　基础培养基：蔗糖6.00 g，硫酸镁0.30 g，硫酸铵0.20 g，氯化钠5.00 g，琼脂粉18.00 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
　　斜面培养基：采用LB培养基[10]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 菌株产钾能力测定。
　　目标菌株在LB培养基中活化培养后，取OD600=0.2的菌液按2%接种量接种于发酵培养基，设置不接种的空白对照，在28 ℃、160 r/min条件下培养7 d。每24 h取样一次，于4 ℃、1 000 r/min离心10 min，采用火焰分光光度计测定离心后上清液中水溶性速效钾含量[2，11]。3次重复取平均值，下同。
　　1.2.2 菌株生長特性测定。
　　糖发酵能力：在基础培养基中分别选取葡萄糖、支链淀粉、直链淀粉、麦芽糖和乳糖作为糖源配制培养基，按2%接种量（OD600 = 2，下同）接入待测菌株，在28 ℃培养48 h，观察杜氏管内气体高度。
　　碳同化能力：在基础培养基中分别选取葡萄糖、支链淀粉、直链淀粉、麦芽糖和乳糖作为碳源配制培养基，按2%接种量接入待测菌株，培养28 ℃培养72 h，用分光光度计测定菌体OD600。
　　氮同化能力：在基础培养基中分别选取硫酸铵、硝酸钾、尿素、酵母膏和蛋白胨作为氮源，按2%接种量接入目标菌株，28 ℃培养72 h，用分光光度计测定菌体OD600。
　　生长温度：在基础培养基中分别按2%接种量接入待测菌株，分别置于16、20、24、28、32、36、40 ℃条件下培养72 h，用分光光度计测定菌体OD600。
　　生长pH：分别将基础培养基的pH调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%接种量接入待测菌株，28 ℃培养72 h，用分光光度计测定菌体OD600。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株ZMD02的解钾能力
　　经过7 d连续发酵，菌株ZMD02发酵上清液中，速效钾含量存在变化，发酵液中的速效钾含量从第3天开始迅速增加，第6天达到最大值1.5 μg/mL，而对照的速效钾含量未见增加，说明未接种ZMD02的对照中不存在从钾长石中分解释放出的游离态有效钾（图1）。故ZMD02具有解钾活性，定性为解钾菌。
　　2.2 菌株ZMD02的生长特性
　　由图2可知，菌株ZMD02对5种糖源的发酵产气能力存在明显差异，由大到小依次为葡萄糖>麦芽糖>乳糖>直链淀粉>支链淀粉。考察ZMD02对碳同化的能力时，也显示出不同，由大到小为麦芽糖>葡萄糖>乳糖>直链淀粉>支链淀粉，说明麦芽糖是菌株生长的最佳碳源（图3）。ZMD02对5种氮源的同化能力表现为酵母膏>蛋白胨>硫酸铵>硝酸钾>尿素（图4）。ZMD02的最适生长温度为28 ℃，低于20 ℃和高于36 ℃时，菌株长势明显减弱（图5）。中性酸碱度环境是ZMD02的最适生长pH（图6）。
　　3 讨论
　　该研究从烟草根际土壤中分离获得菌株ZMD02，菌株经7 d发酵后发酵上清液中速效钾含量达1.5 μg/mL，解钾活性较强，无论作为诱变育种的出发菌株或直接作为生物钾肥原始菌株，均具有较高的研究价值和开发潜力。土壤是微生物的大本营，根际环境因为植物根系活动与微生物的代谢经过长期的协同进化，从根际环境分离出的土著菌株，在应用开发上具有天然的生态适应性优势[12-13]，因此，ZMD02对烟草生产具有重要意义。虽然土壤中微生物种类繁多，但不同生境的微生物多样性特征存在差异，很多时候即使是同一种微生物，来源不同，微生物个体的生物学特征也表现出特定的差异[12，14]，因此大量分离功能菌株，仍是一项非常具有价值的基础性工作。  　　土著菌株初始酶活性的高低常常不能作为判断该菌株是否具有价值的唯一依据，且土著野生菌株直接应用往往出现田间施用效果不稳定的情况，故后期通过紫外线、化学诱变剂等提高土著出发菌株的功能效果，几乎是菌株深度开发的必要环节[15-17]，因此，对ZMD02的后续工作将着重加强这方面的研究。该研究对ZMD02菌株生长特性的初步探索，明确了菌株不同碳源、氮源、生长温度和酸碱度的响应特征，也为后期的理论和应用研究提供了有益参考。
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