双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

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　　摘要 异沙叶蝉可传播小麦矮缩病毒 Wheat dwarf virus（WDV）和小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus（WYSV）两种病毒。本文根据WDV和WYSV的基因序列分别设计两种病毒的特异性引物对，以含有上述两种病毒的异沙叶蝉样品总RNA为模板，以随机引物为3′端通用引物反轉录获得cDNA， 然后在同一个PCR反应体系加入两对引物， 分别得到与预期相符的773 bp和322 bp扩增产物条带。通过对引物浓度、dNTP和rTaq用量以及退火温度等条件进行优化，建立了能在同一异沙叶蝉体内检测WDV与WYSV两种小麦病毒的双重RT-PCR方法。该双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地在一个体系里同步检测介体昆虫体内的两种病毒，有效地检测虫体内病毒带毒率，这些结果可为病毒预测预报和病害防治提供参考。
　　关键词 异沙叶蝉; 小麦矮缩病毒; 小麦黄条纹病毒; 双重RT-PCR
　　中图分类号： S 435.12
　　 文献标识码： A
　　 DOI： 10.16688/j.zwbh.2019079
　　Simultaneous detection of two wheat viruses harbored by a single
　　leafhopper （Psammotettix alienus） by duplex RT-PCR
　　DU Zhenzhen， LIU Yan， WANG Xifeng
　　（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，
　　Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）
　　Abstract
　　It was found that the leafhopper （Psammotettix alienus） can transmit both Wheat dwarf virus （WDV） and wheat-infecting virus-Wheat yellow striate virus （WYSV）. Here， the specific primer sets for WDV and WYSV were designed according to viral genomic sequences， respectively. Total RNA of leafhopper， which was positive for both WYSV and WDV， was used as a template for the first strand cDNA synthesis. Reverse-transcription was performed using random primer as 3′ primer for each virus. WDV and WYSV specific primer sets was then added into the PCR system producing two distinct fragments of 773 and 322 bp， respectively. A method of duplex reverse-transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was developed for the simultaneous detection of WDV and WYSV in single leafhopper. The specific reagents and enzymes in the duplex RT-PCR reaction system， primers， dNTPs， and rTaq were first optimized by testing different concentrations and volumes of these components and the annealing temperature was then optimized. Thus， the duplex RT-PCR method optimized in this study was to develop and validate a highly specific and simple RT-PCR method for accurate detection of two viruliferous rates of leafhopper population， which could facilitate better forecasting and control of the virus diseases.
　　Key words
　　Psammotettix alienus; Wheat dwarf virus; wheat yellow striate virus; duplex RT-PCR
　　异沙叶蝉Psammotettix alienus Linnaeus是一种农业害虫，隶属于半翅目叶蝉科Cicadellidae沙叶蝉属Psammotettix [1]。它广泛分布于欧洲、非洲北部、北美及亚洲中北部地区，同时也是我国西北、华北地区干旱、半干旱地区麦田叶蝉的优势种[23]。异沙叶蝉不仅通过刺吸小麦、大麦等多种禾本科农作物植株的茎、叶汁液对作物造成危害，更为重要的是它在取食的同时可传播多种病毒。因此，异沙叶蝉的大发生往往同时伴随着这些病毒病害的大面积流行，其传播病毒造成的危害远大于直接取食，给粮食作物生产带来了严重的损失。 　　由异沙叶蝉以持久性非增殖方式传播的小麦矮缩病毒Wheat dwarf virus （WDV） 属于双生病毒科Geminiviridae玉米线条病毒属Mastrevirus的成员之一，病毒全基因组由2 739～2 750个核苷酸组成，为单链环状DNA病毒[45]。感染小麦矮缩病毒的植株多表现严重矮化，分蘖增多，甚至无法抽穗。小麦矮縮病是小麦生产上威胁性较大的病害之一，在全世界小麦主产区特别是欧洲各国多次流行造成小麦严重减产[6]。此外，近年来发现异沙叶蝉还能以持久性增殖方式传播小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus （WYSV）。小麦黄条纹病毒是2016年在陕西韩城田间发现的一种危害小麦的负单链RNA新病毒，该病毒基因组全长为14 486 nt，以“N-P-P3-M-G-P6-L”顺序依次编码7种结构蛋白，是弹状病毒科Rhabdoviridae细胞核弹状属病毒Nucleorhabdovirus的暂定种[7]。与被小麦矮缩病毒侵染后产生的症状不同，感染小麦黄条纹病毒的小麦无明显矮化，发病植株叶片沿叶脉失绿、严重黄化，并从叶尖干枯开始逐渐发展为整株叶片枯死。WYSV可侵染小麦、大麦以及燕麦等多种麦类作物，是生产上一种潜在的威胁。
　　带毒介体的病毒检测通常采用血清学和分子生物学等手段[810]。血清学具有快速简便、高通量等优点，但对抗体的特异性有较高要求。分子检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点被广泛应用于带毒介体的快速检测和鉴定[1113]。多重PCR是一种PCR衍生方法，它的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，可对多个靶标进行同时检测。本研究针对异沙叶蝉体内携带的WDV和WYSV两种病毒设计特异性引物，优化反应和扩增条件，建立了特异、高效的双重PCR检测体系，实现了同一虫体两种病毒的同步检测，为病毒预测预报提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试异沙叶蝉的来源与保存
　　异沙叶蝉采自陕西韩城普通小麦田块。经PCR检测无毒的异沙叶蝉后代种群在健康小麦上扣罩饲养繁殖。WDV和WYSV病毒分离物在小麦品种‘扬麦12’上经异沙叶蝉传毒繁殖，常年保存在22℃±1℃， 20 000 lx的光照培养箱中。无毒异沙叶蝉2龄若虫取食WDV和WYSV病毒毒株4 d后转移到健康小麦上备用。
　　1.2 异沙叶蝉总RNA的提取
　　将单头新鲜或冰冻的异沙叶蝉放入1.5 mL离心管中，用带有无线电动机的研杵（北京天根生化科技有限公司）研磨数秒之后迅速转移入液氮中冷冻，重复直至异沙叶蝉被充分研磨至粉末状，然后加入200 μL TRIzol（Invitrogen， USA），剧烈摇晃混匀，冰上静置5 min;加入40 μL氯仿，用力摇15 s，冰上静置5 min;4℃，12 000 r/min离心10 min;将上清转入新的离心管加入与上清等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min;4℃，12 000 r/min离心15 min，去上清;加入500 μL预冷的75%乙醇（灭菌的DEPC水配制），洗涤沉淀。4℃，12 000 r/min离心5 min，弃上清，重复上述洗涤步骤，以彻底洗干净盐分;真空干燥后用15 μL灭菌的DEPC水溶解。
　　1.3 特异性引物的设计
　　比对GenBank中已报道的WDV（GenBank no.KJ536138）和WYSV（GenBank no. MG604920）的病毒全基因组序列， 发现这两种病毒的序列全长分别为2 750 bp和14 486 bp，同源性极低。分别根据两种病毒的外壳蛋白基因及部分上下游序列区域，应用 Primer Premier 6.0软件设计这两种病毒的多对特异性检测引物，每对引物选择相似的退火温度且不同的PCR产物大小及避免二级结构和引物之间的互作，经RT-PCR验证特异性最终选择其中两对引物作为双重RT-PCR的引物，具体引物信息如表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
　　1.4 单一RT-PCR检测体系
　　利用随机引物反转录合成cDNA。cDNA合成体系总体积为20 μL，其中样品RNA 3 μL，10 μmol/L随机引物（全式金生物有限公司）1 μL， DEPC H2O 6 μL， 混匀后95℃变性2～3 min，立即置于冰上2 min;然后加入2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 5× M-MLV buffer 4 μL， 200 U/μL M-MLV反转录酶（Promega， USA）1 μL，40 U/μL RRI（TaKaRa）0.5 μL，用DEPC H2O补足至20 μL。混匀后，37℃孵育1 h， 70℃ 10 min，-20℃保存。以合成的cDNA为模板，分别利用WDV和WYSV的特异性引物进行扩增。PCR体系：cDNA 3 μL， 25 mmol/L 10×PCR buffer （Mg2+ plus） 2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 10 μmol/L 上下游引物各0.5  μL， 5 U/μL rTaq（TaKaRa） 0.1 μL，用超纯水补足至25 μL。扩增程序如下：94℃ 3 min; 94℃ 30 s，55℃ 45 s和72℃ 50 s，35个循环;72℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。同时设置无毒异沙叶蝉RNA为阴性对照。
　　1.5 双重RT-PCR体系的建立与优化
　　分别取单一RT-PCR检测结果为阳性的只携带WDV或WYSV的异沙叶蝉RNA各1.5 μL或者是同时携带两种病毒的异沙叶蝉RNA 3 μL，利用1.4中的方法合成cDNA。双重RT-PCR与单重RT-PCR体系的其他试剂成分和反应条件相同。以只携带WDV或WYSV的异沙叶蝉RNA和无毒异沙叶蝉RNA为对照。为了优化双重RT-PCR体系，以上述合成的cDNA作为双重PCR反应模板，对rTaq、dNTPs浓度以及退火温度进行优化，优化某一因子时保持其他条件不变。5 U/μL rTaq DNA 聚合酶设0.1、0.2、0.3、0.4 μL和0.5 μL 5个处理;2.5 mmol/L dNTPs设1、2、3、4 μL和5 μL 5个处理;退火温度设51、53、55、57℃和59℃ 5个梯度。 　　1.6 双重RT-PCR的灵敏度测定
　　为检测双重RT-PCR体系的灵敏度，将浓度为200 ng/μL的cDNA按10倍梯度进行系列稀释（10-1～10-4），再取3 μL cDNA为模板按照优化后的最佳条件分别进行PCR扩增，通过观察电泳结果分析双重RT-PCR检测的灵敏度。
　　1.7 双重RT-PCR的初步应用
　　从陕西韩城田间采集的17头异沙叶蝉，分别提取全虫的总RNA，采用优化的双重 RT-PCR体系检测同一头虫体里携带WDV或WYSV的情况。将获得的WYSV和WDV扩增产物通过纯化回收，连接到pEASY-T5载体上，导入到感受态细胞Trans-T1中，将菌液PCR扩增阳性的样品送上海生工生物有限公司测序，并利用Vector NT软件对得到的序列进行比对分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 双重RT-PCR检测体系的建立
　　用浓度0.1 μmol/L的WDV和WYSV两对特异性引物分别对相应病毒的cDNA模板进行单一RT-PCR扩增，分别能够扩增出773 bp和322 bp特异性条带，符合设计目的条带大小。对引物浓度进行了优化，确定了上述两对特异性引物在同一PCR体系中最佳使用终浓度分别为0.12 μmol/L和0.08 μmol/L，即WDV與WYSV引物对的比例为3∶2。按这个比例将两种引物加入到体系中，单独携带WYSV或WDV的有毒虫及和同时携带WYSV和WDV的有毒虫的RNA样品均能扩增出相应病毒的特异性条带，且无非特异性条带，表明两对引物有良好的兼容性（图1）。
　　2.2 双重RT-PCR检测体系的优化
　　以RT-PCR产物为模板，对dNTPS，rTaq以及退火温度等因子进行进一步优化，确定WDV和WYSV双重RT-PCR检测体系最优的条件为：在总体积25 μL的PCR体系中含有3 μL cDNA，2 μL浓度为2.5 mmol/L 的dNTPS、0.1 μL rTaq（5U/μL）以及浓度为10 μmol/L WDV、WYSV上下游引物各0.3 μL和0.2 μL。PCR扩增反应条件为：94℃ 3 min， 94℃ 30 s、55℃ 45 s 和72℃ 50 s共35 个循环;72℃ 10 min（图2）。
　　2.3 双重RT-PCR的灵敏度测定
　　为检测双重RT-PCR体系的灵敏度，将浓度为200 ng/μL的cDNA按10倍系列稀释（10-1～10-4），结果表明双重RT-PCR的检测下限是10-2的cDNA，当稀释100倍时，双重检测体系中WDV的条带比较模糊，而WYSV的条带依然清晰。当稀释了1 000倍时没有WDV目的条带出现，结果如图3。
　　2.4 双重RT-PCR的初步应用
　　用优化好的双重 RT-PCR体系对来自陕西韩城的17头叶蝉样品进行检测，发现单头虫体里既有WDV或WYSV一种病毒单独存在的情况，也有这两种病毒同时存在的情况（图4）。将从双重RT-PCR体系中获得的其中3个WYSV 和WDV扩增产物分别通过克隆测序，序列比对表明扩增得到的序列与参考序列一致性均超过了99%，证明了建立的双重RT-PCR检测的可靠性。
　　3 讨论
　　在自然界中，寄主植物往往受到两种或两种以上植物病毒的复合侵染，同一介体昆虫也可以传播两种或两种以上不相关的植物病毒[1415]，这给病毒病害流行监测带来了一定的困难。PCR方法具有快速、特异、灵敏和重复性好的优点，但是单一PCR方法用于多种病毒感染的田间样品鉴别诊断时，不能一次达到目的，并且对样品需求量大，耗时较长。近年来，基于PCR技术建立的多重PCR或RT-PCR检测方法已广泛应用到植物病毒的检测中[1617]，亦被成功地应用于虫传植物病毒在介体昆虫中的检测，例如在同一灰飞虱体内水稻条纹病毒Rice stripe virus（RSV）和水稻黑条矮缩病毒Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV）两种病毒的检测[18]。
　　WYSV是近年来我国西北部麦区新发现的一种可侵染麦类作物的植物弹状病毒。WDV的传毒介体异沙叶蝉也是目前发现的可传播WYSV病毒的唯一介体。异沙叶蝉的带毒虫量是这两种小麦病害发生流行的关键因子，因此建立一种快速、灵敏检测异沙叶蝉带毒率的方法十分必要。但异沙叶蝉体型较小，成虫体长仅3～4 mm，单独提取同一个体较难满足DNA和RNA的用量。虽然WDV是一种DNA病毒，但其转录过程产生的病毒mRNA可以作为RT-PCR的模板[1920]。因此本研究提取异沙叶蝉总RNA，用随机引物进行反转录，一次性合成cDNA作为双重RT-PCR体系的模板，在同一个反应体系加入兼容性好的两种病毒特异性引物对进行PCR扩增，组建了WDV与负单链RNA病毒WYSV的同步检测体系。本研究还对引物浓度、dNTPs和rTaq用量以及退火温度等条件进行了优化，发现两种引物浓度配比以及dNTPs的用量是该RT-PCR体系的关键。建立的双重RT-PCR方法不仅可以应用于同一异沙叶蝉体内快速同步检测WYSV和WDV两种小麦病毒，亦可用于麦类作物样品中这两种病毒的检测，确认单一感染或混合感染，达到快速诊断、鉴别的目的，比常规PCR或RT-PCR方便快捷，节约试剂和降低检测周期。因此，本方法的建立将为异沙叶蝉带毒率的检测及田间小麦矮缩病毒病和小麦黄条纹病毒病的流行监测提供技术支持，服务于小麦虫传病毒病害的防治。
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　　（责任编辑：杨明丽）
　　收稿日期： 20190225   修订日期： 20190322
　　基金項目：国家重点研发计划（2016YFD0300705）;国家自然科学基金（31871938）
　　致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。
　　通信作者E-mail：yliu@ippcaas.cn
　　#为并列第一作者
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