不同碳氮比对小球藻增殖及油脂积累的影响

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　　摘要 为了研究不同碳氮比对小球藻增殖及油脂积累的影响，采用BBM培养基，以蔗糖为碳源，硝酸铵为氮源，在12 h光照和12 h黑暗的条件下混合培养小球藻。设计不同的碳氮比例，采用OD680来评价小球藻的生长情况，以盐酸破壁后用提取液提取油脂，计算不同处理下的小球藻油脂积累情况，并利用气相测定脂肪酸成分。结果表明：60/1比例下藻种出现最大的生长量，其次是30/1。而30/1比例下藻种出现最大的油脂积累率，其次是60/1。检测得各处理所含脂肪酸成分基本相同，均含有C14、C15、C16、C17、C18、C20;而30/9和60/1处理还含有C12成分。30/1和60/1这2个处理含主要脂肪酸为C16∶0、C18∶0和C18∶2，含量为70%～74%，其余4个处理主要脂肪酸为C16∶0和C18∶0，含量为80%～86%。
　　
　　关键词 小球藻;碳氮比;生长量;油脂积累
　　
　　中图分类号 TE667 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）11-0007-04
　　Abstract To investigate the effects of different carbonnitrogen ratios on Chlorella’s proliferation and lipid accumulation，BBM medium was used to culture Chlorella under 12hour of light and 12hour of darkness with sucrose as carbon source and ammonium nitrate as nitrogen source. Different ratios of carbon and nitrogen were designed，OD680was used to evaluate the growth of Chlorella，the oil was extracted after the cell wall was broken by hydrochloric acid. The oil accumulation of Chlorella was calculated under different treatments.And the composition of fatty acids was determined by gasphase. The experimental results showed that the maximum growth rate of Chlorella was 60/1， followed by 30/1. While 30/1 radio showed maximum oil accumulation rate， followed by 60/1. The fatty acid composition in each group was basically the same， including C14， C15， C16， C17， C18and C20， while the treatment of 30/9 and 60/1 also contained another C12. The main fatty acids in 30/1 and 60/1 groups were C16∶0， C18∶0and C18∶2， with the content of about 70%-74%， while the other four treatments were C16∶0and C18∶0， with the content of about 80%-86%.
　　Key words Chlorella;Carbonnitrogen ratio;Growth;Lipid accumulation
　　
　　近年来随着煤炭、石油等化石燃料的日益枯竭，科学家们将研究对象转向高效、清洁、可再生的生物能源。生物柴油是一种以动植物油脂为原料制备、可替代化石柴油的绿色新能源。然而，以动植物油脂为原料的生物柴油其原料成本占总生产成本的75%左右并且消耗大;可食用的植物油脂以餐饮废弃油脂为原料虽然可有效降低生产成本，但原料来源有限，难以满足大规模生产的需要，且产品的质量难以保证。微藻是一类单细胞藻类，其在特定的条件下可大量积累油脂，而且藻油具有与一般植物油脂类似的脂肪酸结构，因此被认为是一种具有巨大潜力的新型生物柴油油脂原料[1]。与油料作物相比，微藻具有细胞增殖快、生产周期短、不受季节和土地的限制和所需的培养基来源丰富等优点[2]。因此，通过培养微藻获取藻油对于保证油脂原料的可持续供应，促进生物柴油的广泛生产和应用具有重要意义[3-4]。该研究以小球藻（Chlorella sp.）为材料，通过设计不同的碳氮比例对小球藻进行培养，记录过程中小球藻各指标的变化情况，计算并分析相关数据得出有关规律，最终选出最适于小球藻增殖和油脂积累的碳氮比。
　　1 材料与方法
　　1.1 藻种
　　小球藻（Chlorella sorokiniana）从中国科学院武汉水生生物所购得。
　　1.2 仪器和设备
　　AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）;SW-CJ-1C型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）;SpH-3332型基本型大容量雙层摇瓶机（上海世平实验设备有限公司）;7230G型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）;TDL80-2B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;101-1型电热鼓风干燥箱（上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）;CF16RXⅡ型高速冷冻离心机（Hitachi Koki Co.，Ltd.）;HH-4型数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）;GC-2010型气相色谱仪（日本岛津公司）。 　　1.3 不同培养基的配置
　　小球藻采用BBM培养基（4.5 L）为基本培养液（表1）。另在BBM培养液中加入蔗糖和硝酸铵的量分别为10.26、0.08，10.26、0.24，10.26、0.72，20.52、0.08，20.52、0.24，20.52、0.72 g/L，使6种培养基中的C/N比为30/1、30/3、30/9、60/1、60/3、60/9。
　　1.4 藻种培养
　　试验在装液量为300 mL的500 mL圆底烧瓶中进行。接种量为5 mL[3]，培养温度为室温，初始pH为7.0，光照时间为12 h黑暗交替，光照强度为2 000 lx，摇床转速为120 r/min。自接种日到试验结束共培养18 d。
　　1.5 样品测定
　　1.5.1 细胞生长的测定。采用7230G型紫外分光光度计测定藻液在680 nm波长处的吸光度值，用OD680变化表征小球藻的生长情况[5]，每个比例选择一个样品做3个重复，结果取平均值。从接种日起，隔2 d测1次，培养18 d后结束。
　　
　　
　　1.5.2 藻粉的收集。收集不同培养阶段的小球藻藻液，以3 000 r/min的转速离心5 min，弃上清液，蒸馏水冲洗藻泥，收集藻液，在80 ℃的温度下烘干至恒重。
　　1.5.3 油脂的收集及含量测定。①将收集的干燥小球藻藻粉研磨均匀。②每个比例都称取0.04 g左右（重量计为m）藻粉放入10 mL的离心管中。每个样品做3个重复。③向装有藻粉的离心管中加入0.5 mL的濃盐酸，盖上盖子在80 ℃水浴10 min，开盖继续水浴5 min。④经盐酸处理后，再向离心管内加入1∶1的乙酸乙酯和正己烷的提取液进行提取。加入提取液的离心管在水浴中多次摇晃混匀，提取10 min，共提取3次，每次提取液的量分别为5、4、4 mL。⑤在11 000 r/min的转速下离心10 min，提取后的溶液合并入20 mL的离心管中，加入6 mL蒸馏水，在3 000 r/min的转速下离心5 min。⑥准备足量干燥的培养皿并称重记为W1，将离心后的上层液取出混合放入已准备的干净培养皿内，恒温水浴挥干提取剂。⑦培养皿烘干后，再称取培养皿重量记为W2，故油脂含量C=（W2 - W1）/m×100%。   
　　1.5.4 油脂成分的测定。用气相色谱测定脂肪酸成分，以氢火焰检测器检测。其工作条件为载气（N2）流速为3 mL/min;升温程序：100 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速度升温至180 ℃，再以3 ℃/min的速度升至240 ℃，保持9 min;氢火焰检测器中H2的流速为47 mL/min，空气流速为400 mL/min，温度为250 ℃。
　　1.6 数据分析 用Excel 2003分析统计数据，并作图。用SPSS15.0软件进行方差分析和多重比较（Duncan’s检验，α=0.05）。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同碳氮比对小球藻增殖的影响
　　小球藻从接种到收获共培养18 d。随着培养时间的推移，培养液颜色逐渐由无色变成绿色再变成棕黄色最后变成黄白色。但培养液颜色发生变化的起始时间及变化程度因碳氮比例不同而不同。具体地，60/9处理最先发生颜色变化;随后，30/9、60/3、30/3等处理依次发生变化;而30/1、60/1处理在培养过程中颜色变化不明显（图1）。Prabakaran等[6]研究表明，氮源供应不足会导致藻胞内叶绿素和胡萝卜素合成受到限制，使得藻胞呈色变化不明显。这合理地解释了我们所观察到的现象。
　　 小球藻培养18 d内每个样品各测取OD6806次，数据显示每个处理的变化趋势是随着时间推移而波动的。由图2可知，当小球藻生长达到稳定期时，碳氮比为60/1的小球藻OD680最大，达0.916;其次是30/1的处理，为0.767;60/3、30/3和30/9这3个处理的最终值相近，为0.650～0.690;而60/9处理的OD680最小，为0.544。其中，60/1、30/1这2个处理的数值变化逐渐上升;60/3、30/3和30/9这3个处理的变化是先上升后下降;而60/9处理的变化不明显。数据表明碳氮比值较大可促进小球藻生长，碳氮比值大即碳源量相对较大，这与刘香华等[7]研究表明的碳源有利于小球藻的增殖理论相一致。同时可初步确定小球藻生长所需的碳氮最适配比为60/1，其次是30/1。
　　2.2 不同碳氮比对小球藻油脂积累的影响
　　2.2.1 油脂积累情况。取不同培养时间的小球藻藻液测定其油脂百分含量，共计3次。分析发现，培养初期，小球藻的油脂积累率最高为处理30/1，最高值为27.86%;培养中期，小球藻的油脂积累率最大值为30.70%，该值在处理30/1中测得;培养末期，小球藻的油脂积累率由高到低的处理顺序是30/1、60/1、30/3、60/9、30/9、60/3，最高达34.32%（图3）。其中，30/1处理在培养末期达到最大的油脂积累率，为3432%;其次是处理60/1，达30.09%，而30/3、60/3、30/9、60/9四者的油脂积累率相近，为17.6%～25.70%。
　　2.2.2 油脂积累率方差分析。第6天，处理30/1和其他5组处理间存在极显著性差异（表2）;处理30/3分别和30/9、60/9存在极显著性差异;处理60/1、60/3与30/9、60/9也存在极显著差异。第12天，处理30/1和处理30/9、60/3、60/9存在极显著差异;处理60/1、30/3和处理30/9、60/3、60/9也都存在极显著差异。第18天，处理30/1和其余各处理都存在极显著差异。综上可初步确定小球藻油脂积累的最佳碳氮配比是30/1，其次是60/1。 　　2.3 不同碳氮比对小球藻脂肪酸组成的影响
　　研究表明[8]在同浓度的相同碳源中，处于稳定期的小球藻更趋向于油脂的积累，该试验所研究的即是稳定期不同碳氮比培养基中小球藻脂肪酸组成成分（表3）。6个不同碳氮比处理的小球藻油脂中都包含了C14、C15、C16、C17、C18、C206种脂肪酸成分;而处理30/9和60/1的小球藻油脂中除上述6种脂肪酸外还具有C12脂肪酸。其中30/1和60/1两者的小球藻油脂中主要脂肪酸为C16∶0、C18∶0和C18∶2，占总脂肪酸含量的70%～74%，其余四者的小球藻油脂中主要脂肪酸为C16∶0和C18∶0，占总脂肪酸含量的80%～86%;各個处理油脂成分都由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸三者组成，其中饱和脂肪酸总量远大于不饱和脂肪酸总量。具体地，30/1和60/1组合多不饱和脂肪酸大于单不饱和脂肪酸的现象较为明显，而其余组合这2种不饱和脂肪酸的含量相差不明显[9]。
　　
　　3 结论与讨论
　　氮源供应不足会导致藻胞内叶绿素和胡萝卜素合成受到限制，使得藻胞呈色变化不明显。较大的碳氮比可促进小球藻的生长，即高碳低氮的处理环境有利于小球藻增殖。该试验初步确定小球藻生长所需的碳氮最适配比为60/1，其次是30/1。在氮浓度较低的情况下，碳氮比较小者可促进油脂的积累。该试验初步确定有利于小球藻油脂积累的最适碳氮配比是30/1，其次是60/1。各处理所含脂肪酸成分基本相同，分别为C14、C15、C16、C17、C18、C206种，而30/9和60/1处理除以上成分之外，还含有C12脂肪酸。30/1和60/1这2个处理主要脂肪酸为C16∶0、C18∶0和C18∶2，含量为70%～74%，其余四者主要脂肪酸为C16∶0和C18∶0，含量为80%～86%。各个处理油脂成分都由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸三者组成，其中饱和脂肪酸总量远大于不饱和脂肪酸总量。
　　
　　
　　
　　近年内，科学者对小球藻增殖和油脂积累情况的研究有了不少的成果。众多研究表明培养基中氮水平是影响微藻生化成分的最主要因素。故大多数关于氮源的研究都是在低氮浓度，即氮限制的条件下进行的。也有少量文献报道了非限制性或高氮浓度下的微藻培养，这通常可得到总生物量或某种成分的最大生成量，但总脂占干重的百分数有所下降。众多研究证实随着氮浓度的减少，小球藻生长量也随之减少但其油脂积累增加，因为在氮不足时碳元素更多地趋向于合成脂质和碳水化合物，同时导致细胞生长缓慢，相对高浓度的氮源有利于生物量的增加但不利于油脂的积累[5，7]，该试验现象与之相符。
　　在不同的碳氮比下研究细胞内油脂的含量和脂肪酸的组成，发现碳限制或氮限制均能促进细胞内脂肪的合成。但前者更为明显，因为较低的碳氮比使不饱和脂肪酸增加更为明显。当碳氮比较高时，碳供应过量，氮成为限制性因素，此时细胞内脂肪含量的增加可用碳储存机制解释。氮限制性培养常会增加细胞内脂肪酸的饱和程度，这可能是因为氮是合成氨基酸所必需的元素，氮限制性培养会使氨基酸的合成减少，从而引起蛋白质含量丰富的色素体的生成减少，进而导致对磷脂以及与这些细胞器相关的甘油脂（均为膜结构组分）的需求降低。细胞内主要的长链不饱和脂肪酸绝大部分位于细胞膜的极性脂中，所以当膜结构减少时，PUFA含量相应下降[10]。这可以用来解释该试验中图3的部分结果。因为脂类中脂肪酸分布不同，所以由培养条件和生长期的变化引起的脂类组成的变化将导致胞内总的脂肪酸组成的变化。
　　该试验研究了小球藻培养液中不同碳氮比对小球藻增殖、油脂积累和脂肪酸成分的影响，所得结果可从碳氮比整体、碳氮各自浓度高低、生长期等各方面进行分析，它是一个交互影响的结果。
　　参考文献
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