污染严重的海带配子体分离纯化
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作者:武瑞娜 罗世菊 赛珊 赵聚萍 李晓捷
摘 要：针对海带（Saccharina japonica）配子体保存过程中严重污染材料的分离纯化进行研究。（1） 液相培养分离纯化法：将克隆材料经超声波细胞粉碎仪打碎后重新附着到90 mm培养皿中，利用微毛细吸管在显微镜下分离出状态好且无菌丝附着的细胞段，继续保存。（2） 固相培养分离纯化法：将克隆材料4 000 r/min离心5～10 min，弃上清，加灭菌PESI培养液重新悬浮藻液，利用5 mL无菌注射器吸取2 mL粉碎后的配子体细胞，逐点注射入固相平板上，接种后利用Parafilm封口膜密封培养皿，平板培养约60～120 d后观察，将未长出菌落且藻斑直径达2 mm的克隆团挑出，然后在PESI液体培养基中复苏继续保存。
关键词：海带（Saccharina japonica）;配子体;液相培养;固相培养;分离纯化
海带（Saccharina japonica）自然分布于太平洋和大西洋北部沿海，是一种冷水性大型经济食用海藻。1927年从日本海域引入我国海域[1-2]，然后渐渐适应了我国的海洋环境条件。大型的叶状体孢子体世代和微小的配子体世代是海带典型异形世代交替生活史中的两个世代[3]，叶状体为二倍体，配子体为单倍体。
海带配子体是海带种质资源的重要保存形式，海带配子体在保存过程中会存有细菌和真菌污染，严重影响了海带配子体的正常生长和保存，甚至导致海带优良种质的丢失。本论文主要围绕保存过程中严重污染海带配子体的分离纯化方法进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料及培养基的制备
实验材料：本实验室保存过程中被细菌和真菌污染严重的配子体克隆。
实验器材：智能型超声波细胞粉碎机，显微镜（Olympus），孔径约500 μm的微毛细吸管（利用酒精喷灯在通风橱内将玻璃滴管拉制成的），15 mL玻璃材质的试管，250 mL玻璃材质的蓝盖瓶，灭菌的脱脂棉，离心机，苏州净化设备有限公司出产的超净工作台，5 mL无菌注射器。
液相培养基：取经过24 h黑暗沉淀的海水，经过二次砂滤，再经pp棉滤芯棒过滤到5 L的三角烧瓶中，煮沸后冷却至室温，加入营养液摇匀，放置在超净工作台内采用平板滤器抽滤到250 mL蓝盖瓶中备用。
固相培养基：配制1%琼脂的PESI培养基，高压灭菌，待冷却至60 ℃后，用直径9 cm的培养皿倒平板。
1.2 实验方法
1.2.1 液相培养分离纯化 将克隆材料经超声波细胞粉碎仪打碎后经双层300目筛绢过滤到90 mm培养皿中，镜检每个视野约5～8个细胞段，添加培养液至30 mL，放置到培养箱中培养约7～10 d后进行分离。在超净工作台内，用微毛细吸管在显微镜下挑选单个、状态较好、没有菌丝附着的细胞段，放置在5 mm×5 mm的小盖玻片上，通过显微镜检查，细胞段细胞状态好、无污染且仅一个细胞段，然后用镊子将镜检合格的玻片转移到盛有抽滤海水培养液的试管里，试管用灭菌的脱脂棉封口，贴上标签，20支试管为一扎，用皮筋捆好，放入光照培养箱内进行24 h光照培养，约30 d换水一次，换水期间若发现有长菌的试管及时挑出丢弃，保留干净无污染的试管，待细胞段长到米粒大小的克隆团时，用玻璃棒碾碎后，再次进行镜检，确保无污染，可作为长期保存对象。
1.2.2 固相培养分离纯化 将打碎的细胞段利用离心机4 000 r/min离心藻液5～10 min，弃上清，加灭菌PESI培养液重新悬浮藻液，在超净工作台中，利用5 mL无菌注射器吸取2～3 mL粉碎后的配子体细胞藻液，逐点注射入固相平板上，接种后利用Parafilm封口膜密封培养皿; 固相保存温度6～10 ℃，光强1 000～1 500 lx，24 h光照;每隔30 d观察一次，及时将长出菌落严重的平板挑出丢弃，平板培养约60～120 d后观察，将未长出菌落且直径达1～2 mm的藻斑挑出，取得丝状藻团于PESI液体培养基中，在温度7～10 ℃、光强1 000～1 500 lx、光时24 h的条件下复苏培养48 h，转入海水培养液中继续保存，作为保种材料。
2 结果
2.1 液相培养分离纯化
液相分离纯化可以重新分离得到无污染的配子体克隆（图1）。本次实验共分离30支试管，保存下来18支，经过反复镜检筛选最后9支试管作为保种材料，成功率约30%。
2.2 固相培养分离纯化
固相培养分离纯化可以筛选出无污染藻团（图2）。本次实验共接种10个平板，约接种90～120个细胞段，成功转出20个藻团，镜检筛选再分离，最后有10个藻团作为保种材料。
3 讨论
在海带配子体保存过程中，对发生污染的配子体克隆采用液相培养分离纯化法，进行分离纯化，在分离前先用超声波细胞粉碎仪对污染藻团进行处理，超声波对克隆细胞有一定的伤害作用，且随着输出功率和处理时间的增加而提高[4]，所以需要把握好合适的功率和处理时间。液相培养分离纯化是一种可以得到纯净种质的方法，但有时也不能完全去除污染，所以纯化得到的种质要先观察培养，反复镜检，观察一段时间后，确保无污染才能进入保存机制，作为保种材料。
固相培养分离纯化法也是一种可以得到纯净种质的方法，同样有时也不能完全去除污染，此法得到的種质也要先观察培养，反复镜检，观察培养一段时间后，确保无污染才能进入保存机制，作为保种材料。
参考文献：
[1]
李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京：海洋出版社，1996：3-14.
[2] Tseng C K.Algal biotechnology industries and research activities in China [J].Journal of Applied Phycology，2001，13：375-380. [3] Tseng C K.The theory and practice of phycoculture in China[M].Perspectives in Phycology，（ed.Rajarao VN），New Delhi，India：Today and Tomorrow's Printers and Publishers，1990：121-135.
[4] 劉涛，朱明壮，包振民，等.超声波对海带配子体克隆的作用[J].海洋湖沼通报，2000（4）：39-44.
Separation and purification of heavily contaminated Saccharina japonica gametophytes
WU Ruina， LUO Shiju， SAI Shan， ZHAO Juping， LI Xiaojie
（National Engineering and Technique Research and Development Center of Algae and Sea Cucumber of China， Key Laboratory of Genetic Improvement and Efficient Culture of Marine Algae of Shandong Province， Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co.， Ltd.， Yantai， 264003， China）
Abstract：This study focused on the separation and purification of heavily contaminated Saccharina japonica gametophytes during the preservation. （1） Liquid phase separation and purification. The clone material was treated by ultrasonic， reattached to the 90 mm dish， and then isolated the clear cells segments by micro-capillary pipette to continue preservation. 2） Solid phase separation and purification. The contaminated material was centrifuged by 4 000 rpm for 5～10 min， and the precipitation was resuspended by PESI media and infected point by point to the solid phase plate by 5 mL sterile syringe. The plates were inoculated for 60～120 days with sealing by parafilm. The sterile clones of gametophyte with 2 mm diameter were picked out and recovered in PESI media.
Key words：Saccharina japonica; gametophyte;liquid phase culture;solid phase culture;separation and purification
（收稿日期：2020-05-18 ）
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