猫须草提取物体外抗肿瘤活性部位研究

来源:用户上传      作者:郑英换 潘显茂 李兰婷

　　摘要 [目的]研究猫须草不同提取物对多种肿瘤细胞生长抑制的影响，筛选出猫须草的抗肿瘤活性部位。[方法]采用MTT法体外抗肿瘤活性试验研究猫须草提取物分别对人回盲肠癌细胞（HCT-8）、人肝癌细胞（BEL-7402）和人非小细胞肺癌细胞（A549）的生长抑制作用。[结果]猫须草乙醇提取物分别经石油醚萃取、乙酸乙酯萃取后对3种肿瘤细胞均具有良好的抑制活性，而正丁醇萃取物和萃取后的水层无抗肿瘤活性作用。[结论]该研究为后续开展的抗癌活性化学成分单体的提纯和体内抗肿瘤药理试验研究提供理论依据。
　　关键词 猫须草;肾茶;体外抗肿瘤试验;DMSO肿瘤细胞毒性
　　Abstract [Objective] The research aimed to study the different extracts of Clerodendranthus spicatus on growth inhibition of various tumor cells，and to screen out the antitumor active sites. [Method] MTT colourometry was used to determine the inhibitory effect of the different extracts of Clerodendranthus spicatus on hct8 ，bel7402 and A549 human tumor cells in vitro. [Result]The petroleum ether extract and ethyl acetate extract of spicatus had inhibitory activity on three kinds of human tumor cells， but the nbutanol extract and the water extract had no antitumor activity.[Conclusion] This research provides a theoretical basis for the subsequent purification of anticancer active chemical constituent monomers and in vivo antitumor pharmacological test research.
　　Key words Clerodendranthus spicatus;Kidney tea;Antitumor activity in vitro;Tumor cytotoxicity of DMSO
　　猫须草（Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu）为唇形科肾茶属植物，又名肾茶、猫须公，主要分布在我国海南、广西、广东、云南等热带亚热带地区，是一种多年生草本植物，为民间传统中草药[1-2]。猫须草味甘淡、性凉、微苦，具有清热祛湿、排石利水的功效，民间主要用于急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石等多种泌尿系统疾病[3-4]。现代研究表明，猫须草含有黄酮类、二萜类、甾体类、水溶性酚酸类等多种化学成分，并具有抗炎解热镇痛、抗菌、抗氧化、利尿、保肝保肾、降糖降血脂及抗肿瘤等多项药理作用[5-7]。其中猫须草的体外抗肿瘤活性作用研究相对较少，筆者主要通过研究猫须草醇提取物用水分散经石油醚萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取和萃取后水层4种萃取物分别对人非小细胞肺癌细胞A549、人回盲肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞BEL-7402的生长抑制作用，初步筛选出猫须草抗癌细胞活性部位，为后续开展的抗癌活性化学成分单体的提纯和体内抗肿瘤药理试验研究提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　1.1.1 药材与细胞株。
　　猫须草购自海南省万宁市，由郑希龙博士鉴定;人非小细胞肺癌细胞A549、人回盲肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞BEL-7402均购自中国科学院细胞库。
　　1.1.2 主要仪器。
　　Hei-VAP advantage减压旋转蒸发仪（德国海道尔夫）;YRE-2020A智能数显恒温水浴锅（杭州亿捷科技）;DM IL LED 相差倒置显微镜（LEICA德国公司）;BPN-170RWP二氧化碳培养箱（上海一恒）;F-50酶标仪（TECAN奥地利公司）;Countess Ⅱ 全自动细胞计数仪（Thermo Scientific）;LMQ.C-80EP立式蒸汽压力灭菌器（山东新华仪器装备有限公司）;BSA124S-CW分析天平（赛多利斯）。
　　1.1.3 试剂。
　　DMEM高糖培养液、RPIM 1640培养液、小牛血清、胰酶消化液、PBS、青霉素-链霉素溶液，均购自GBIGO公司;MTT，SIGMA公司;95%乙醇、石油醚（I）、正丁醇、乙酸乙酯，均为分析纯，来自西陇科学;DMSO，分析纯，来自广东光华科技。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 猫须草处理方法。
　　取干燥猫须草全草适量粉碎，采用95%乙醇静置提取7 d，药液减压浓缩至无醇味浸膏，加适量蒸馏水混悬后依次用石油醚（I）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并分别浓缩萃取液，回收得猫须草石油醚萃取物（MP1）、乙酸乙酯萃取物（MP2）、正丁醇萃取物（MP3）和萃取后水层（MP4）4种组分浸膏。分别称取上述浸膏适量，用二甲基亚砜助溶，过滤除菌，低温保存备用。临用前用完全培养基梯度稀释至相应浓度。
　　1.2.2 体外抗肿瘤活性试验。
　　取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化计数，分别采用含10%小牛血清细胞完全培养液（A549用高糖DMEM完全培养液，HCT-8和BEL-7402用RPIM 1640完全培养液）制成5.5×104个/mL的细胞悬液，并接种于96孔培养板中，每孔180 μL，置37 ℃，5%CO2培养箱培养过夜后，分别加入不同浓度的猫须草萃取物溶液20 μL。4种猫须草萃取物均设5个剂量组，每组6个复孔，同时设有空白对照组（加20 μL培养液）和调零组（200 μL培养液，无细胞），置37 ℃，5%CO2培养箱分别培养24、48 h后，弃液，PBS洗板1次，加入100 μL无血清培养基和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，弃液，每孔加150 μL DMSO避光振荡（37 ℃）混匀10 min。酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（OD），各孔调零后取平均值计算细胞生长的抑制率，抑制率=（1-样品组OD值/阴性对照组OD值）×100%[8-9]。 　　正式试验前为排除DMSO作为溶剂对各个肿瘤细胞的毒性影响，采用以上试验步骤，设置不同体积分数的DMSO溶液分别测定其对BEL-7402、A549和HCT-8细胞的毒性作用，从而选择合适的药物配比浓度，减小DMSO溶剂对试验结果的影响。计算不同体积分数DMSO对细胞生长的抑制率。
　　1.3 数据统计
　　试验数据用±S表示，采用SPSS 20.0对试验数据进行统计学处理，DMSO数据采用单因素方差分析进行组间比较;计算猫须草各萃取物的细胞半数抑制浓度（IC50）。
　　2 结果与分析
　　2.1 DMSO作为溶剂对肿瘤细胞的影响
　　从3种肿瘤细胞分别经不同体积分数的DMSO处理24、48 h后的细胞生长抑制率（表1）可以看出，与DMSO体积分数为0的空白对照组比较，当DMSO体积分数≤0.6%时，对HCT-8肿瘤细胞毒性作用差异无统计学意义（P>0.05），影响弱;当DMSO体积分数≤0.5%时，对A549肿瘤细胞毒性作用差异无统计学意义（P>0.05），影响弱;当DMSO体积分数≤0.4%时，对BEL7402肿瘤细胞毒性作用差异无统计学意义（P>0.05），影响弱。
　　2.2 猫须草萃取物对肿瘤细胞的影响
　　MTT比色法检测结果表明，猫须草石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物对3种肿瘤细胞均呈现不同程度的抗癌活性;正丁醇萃取物与萃取后的水层均无肿瘤细胞抑制作用。由表2～4可见，猫须草石油醚萃取物对HCT-8肿瘤细胞作用最强，并随着浓度的升高而增强;对BEL-7402和A549的抑制作用虽较弱，但呈现良好的浓度依赖性。猫须草乙酸乙酯萃取物对3种细胞的抑制作用强度相当，对A549、HCT-8细胞的抑制作用呈现良好的浓度依赖性，但对BEL-7402细胞的抑制强度高低浓度时有反复，量效关系较差。
　　2.3 猫须草萃取物对肿瘤细胞的IC50值
　　比较猫须草石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对3种肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50（表5）可知，2种萃取物对HCT-8的作用最显著，作用48 h时IC50分别为109.63和194.61 μg/mL;石油醚萃取物对A549细胞的抑制强度与作用时间长短关系最密切，当作用24 h时IC50>600.00 μg/mL，当作用时间延长至48 h时IC50为273.01 μg/mL。乙酸乙酯萃取物对BEL-7402和A549细胞作用强度相当，48 h时IC50分别为283.05和238.61 μg/mL。
　　3 讨论与结论
　　DMSO作为万能溶剂是许多脂溶性药物进行细胞试验中常见的溶媒，但是在保证药物溶解度的情况下也要考虑DMSO 对细胞的毒性作用，避免其对研究结果产生不良影响。不同的细胞对DMSO的耐受能力不同，且与生产厂家有一定关系[10]。笔者通过对作为溶媒的DMSO进行预试验，选择合适的体积分数范围进行正式试验可减少DMSO对试验结果的影响，有效提高试验结果的准确性。
　　猫须草作为民间常用中草药被广泛应用，多年来研究者们对其研究不断，因其具有良好的保肾利尿作用，已被开发成多种保健茶饮[1]。目前，猫须草研究多限于化学成分和药效学的研究，但对其活性成分的提纯和药物作用机理的深入研究相对较少。笔者通过此次抗肿瘤活性成分研究发现，猫须草经乙醇提取、石油醚萃取、乙酸乙酯萃取后对HCT-8、BEL-7402、A549肿瘤细胞均具有良好的活性作用，为后续开展的活性化学成分的研究和体内抗肿瘤药理学研究提供新的研究方向。
　　参考文献
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