不同弹性蛋白酶酶活力条件下野生与养殖全蝎活性成分含量及体外抗肿瘤实验的对比研究

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　　摘      要：研究了弹性蛋白酶酶活力对野生与养殖全蝎活性成分含量及体外抑制肿瘤细胞生长的影响，筛选了弹性蛋白酶的最佳用量。依据全蝎混合酶解工艺中最佳提取条件，在弹性蛋白酶酶活力分别为2 000、1 000、400、200、20和0 U的条件下，分别测定野生与养殖全蝎中蛋白质和糖胺聚糖的含量及对肺腺癌（A549）细胞的抑制率。结果养殖全蝎的蛋白质含量显著高于野生的，而糖胺聚糖含量则显著低于野生的;养殖全蝎对肺腺癌细胞的抑制效果高于野生全蝎的抑制效果，且当弹性蛋白酶的酶活力为200 U时，养殖全蝎对A549细胞的抑制效果最佳，IC50值为0.331 mg/mL。养殖全蝎对肺腺癌细胞具有较高的抑制作用，弹性蛋白酶的最优酶活力为200 U。
　　关  键  词：野生全蝎;养殖全蝎;糖胺聚糖;蛋白质;抑制率
　　中图分类号：R979.1      文献标识码：A      文章编号：1671-0460（2020）02-0328-04
　　Abstract： To study the effect of different elastase activities on the active components and the inhibition of tumor cell growth in vitro of wild scorpions and cultured scorpions， the optimum use level of elastase was screened out. According to the optimum enzymatic hydrolysis conditions of scorpion， under the condition of 2 000， 1 000， 400， 200， 20 and 0 U of enzyme activity units， the contents of protein and glycosaminoglycan in wild scorpions and cultured scorpions were determined as well as the inhibition rates of lung adenocarcinoma （A549） cell. The results showed that the protein content of cultured scorpion was higher than that of the wild scorpion， but the content of glycosaminoglycan of cultured scorpion was lower than that of the wild scorpion. The inhibitory effect of cultured scorpion on lung adenocarcinoma cells was higher than the wild scorpion. Moreover， when the enzyme activity of elastase was 200 U， the inhibitory effect of cultured scorpion on A549 cells was the best， and the IC50 value was 0.331 mg/mL. Cultured scorpion had higher inhibitory effect on lung adenocarcinoma cells， and the optimal enzyme activity units of elastase was 200 U.
　　Key words： Wild scorpion; Cultured scorpion; Glycosaminoglycan;Protein; Inhibition rate
　　全蝎具有通絡止痛、攻毒散结等功效[1];半仿生-酶法是将半仿生提取法与生物酶结合起来的一种新的有效物质提取方法。首先对中药进行预处理，破坏其细胞结构，加快有效成分的充分溶出，加速提取进程[2]，然后通过仿照人体肠道酸碱度、各种酶的种类以及酶解时间等条件，对样品进行体外酶解处理，从而获得小分子的、具有更高生物活性的肽类物质。近年来，全蝎单味药、全蝎复方药被广泛地应用于临床中，具有镇痛、镇静、抗肿瘤[3]、抗炎以及提高机体免疫[4]等药理作用，极具开发价值。随着全蝎的开发，市场对其的需求量越来越大，为满足市场的需要和实现全蝎药材供应的持续稳定，全蝎养殖正在逐渐兴起，大有逐步取代野生全蝎供应的趋势。但养殖全蝎能否完全替代野生全蝎仍需从各有效成分含量及药理活性等方面进行系统考查。桑晓[5，6]等通过采用HPLC法对比研究了野生全蝎与养殖全蝎中游离牛磺酸的含量及混合酶解后野生与养殖全蝎对肺腺癌细胞的抑制效果，结果表明养殖全蝎的牛磺酸含量和对肺腺癌细胞的抑制效果均高于野生全蝎。焦方文[7]等采用酶解法对全蝎进行单个酶筛选，得出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶对A549细胞的抑制率均高于不加酶的全蝎水提液，并进行了全蝎混合酶解工艺的优化。因此，本项目采用混合酶解法，测定不同酶活力下野生与养殖全蝎的活性成分含量的变化，并以不同环境下的全蝎对A549细胞的抑制率为指标，优化酶解工艺中弹性蛋白酶的酶活力。
　　1  实验部分
　　1.1 药材
　　全蝎购自临沂沂水，经山东中医药大学高德民副教授鉴定为正品。
　　1.2 试剂
　　牛血清蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）;弹性蛋白酶等（上海源叶生物科技有限公司）;阿利新蓝（上海麦克林生化科技有限公司）;Hyclone-1640细胞培养基（赛默飞世尔生物制品北京有限公司）;浓硫酸、硫酸铜等均为分析纯。 　　1.3 仪器
　　UV9100B可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）;DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）。
　　1.4 细胞株
　　肺腺癌细胞由山东省立医院提供。
　　2  实验方法
　　2.1  全蝎粉的制备
　　将购买的全蝎净选，优选出成年蝎，洗净，于冻干机中冷冻，打磨匀浆，冷冻干燥，得全蝎粉。
　　2.2  全蝎酶解液的制备
　　精密称取1.000 0 g全蝎粉置于50 mL具塞锥形瓶，按1∶40料液比加入蒸馏水，超声30 min，pH调至8.5，加入2 000 U的胰凝乳蛋白酶和2 000 U的胰蛋白酶，弹性蛋白酶的量分别为2 000、1 000、400、200、20和0 U，于40 ℃水浴锅中保温3 h，每隔1 h调1次pH值，离心，抽滤，得全蝎酶解液，将酶解液一部分用于含量测定，另一部分用于冷冻干燥得冻干粉。
　　2.3  蛋白质和糖胺聚糖的含量测定
　　采用改良Lorry法[8]測定蛋白质含量，得标准曲线为Y=0.002 2X+0.006 6。取“2.2”项中的全蝎酶解液，稀释到一定体积，于650 nm波长处测定不同酶活力条件下蛋白质的吸光度，按照标准曲线计算不同酶活力的全蝎蛋白质含量。
　　采用阿利新蓝[6]染色法测定糖胺聚糖含量，得标准曲线为Y=0.633 4X-0.006 4。取“2.2”项中的全蝎酶解液，稀释到一定量的浓度，于490 nm波长处测定不同酶活力条件下糖胺聚糖的吸光度，按照标准曲线计算不同酶活力的全蝎糖胺聚糖含量。
　　2.4  体外抗肿瘤实验研究
　　2.4.1  溶液配制
　　称取一定量的不同酶活力的全蝎冻干粉，在无菌条件下，加入一定体积的 1640培养基，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，然后用1640培养基逐步稀释，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL药物浓度。
　　2.4.2  MTT法检测
　　将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞用胰酶进行消化，加入1640培养液制成细胞浓度为1×106 mL的细胞悬液，然后以每孔100μL接种到96孔板上，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后，弃去上清液，每孔加入配好的药物浓度100 μL，每个浓度重复5个孔，阴性对照组加入不含血清的1640培养基100 μL，阳性对照组加入100 μL 100 μg/mL的顺铂溶液，放入培养箱中培养，24 h后，避光，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，放入培养箱中继续培养4 h ，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，摇匀，于492 nm波长处测定OD值，并计算不同药物浓度对A549的抑制率。
　　3  统计学方法
　　采用SPSS17.0统计软件进行分析，用方差分析确定实验之间的差异性及统计学意义，实验数据以xs表示。
　　4  实验结果
　　4.1  不同酶活力的野生与养殖全蝎蛋白质和糖胺聚糖含量的对比
　　由表1可得，养殖全蝎蛋白质含量均高于野生全蝎的蛋白质含量，除酶活力为1 000 U外，其余酶活力的p值均小于0.01，说明两者的蛋白质含量存在极显著性差异。
　　由表2可得，养殖全蝎的糖胺聚糖含量明显低于野生全蝎的含量，且两者的p值均小于0.01，说明野生全蝎与养殖全蝎的糖胺聚糖含量存在极显著性差异。
　　4.2  不同弹性蛋白酶酶活力的野生与养殖全蝎对肺腺癌细胞抑制率的影响
　　由表3实验结果可得，不同药物浓度对A549的抑制效果大体上呈上升态势，当弹性蛋白酶的酶活力分别为2 000、1 000、400、200、20和0 U时，其IC50值分别为0.727、0.485、0.433、0.331、0.457和0.641 mg/mL，由此可得，当弹性蛋白酶的酶活力为200 U时，全蝎混合酶解工艺对A549的抑制效果最佳。
　　表4实验数据均为当药物浓度为1 mg/mL时，不同弹性蛋白酶酶活力的野生全蝎对A549的抑制率。当药物浓度低于1 mg/mL时，药物对A549的抑制作用极弱，且在设定的浓度范围内，1 mg/mL的药物浓度对A549的抑制率最高。
　　5  结论
　　在以前的研究中，野生全蝎酶解的弹性蛋白酶最佳用量为2 000 U[9]，由于弹性蛋白酶的市场价非常高，实验中所使用的弹性蛋白酶的成本占到了整个酶解提取物总成本的80%;本研究成果在明确了同等条件下养殖全蝎抑制肺腺癌细胞株的效果优于野生全蝎的基础上，又进一步探讨了不同弹性蛋白酶用量对体外肺腺癌细胞株的影响，并进而明确了最佳的弹性蛋白酶的用量为200 U，从而使弹性蛋白酶的用量减少了80%，使整个产品成本也降低了大约80%，具有极大的经济效益。
　　蛋白酶解过程不仅可以将大分子多肽酶解为小分子肽、寡肽及氨基酸，还会将一些本来在水中难溶的蛋白质变为可溶，因此不同的酶用量会得到不同的蛋白质含量，但糖胺聚糖不受此影响。养殖全蝎与野生全蝎之间在蛋白质和糖胺聚糖之间的差异多是由其生长的环境条件决定的，与酶解的条件无关。经研究发现养殖全蝎中的蛋白质含量较野生全蝎丰富，而糖胺聚糖含量则野生全蝎中较多，养殖全蝎对A549细胞株的抑制率远高于野生全蝎，可能是因为养殖全蝎营养较有保证造成的。当养殖全蝎的弹性蛋白酶酶活力为200 U时，其对A549细胞的抑制效果最佳。本文主要从野生全蝎与养殖全蝎的活性成分含量及抗肿瘤效果的对比研究中，优化了全蝎酶解工艺中弹性蛋白酶的用量，降低了成本，并为养殖全蝎完全替代野生全蝎用于临床提供了实验基础。
　　参考文献：
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