不同产地野生黄姜中薯蓣皂苷含量的比较

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　　中圖分类号 R917；R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）05-0681-04
　　DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.21
　　摘 要 目的：建立黄姜中薯蓣皂苷含量测定的方法，并对不同产地野生黄姜中薯蓣皂苷含量进行比较。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱柱为Inertsil ODS-3，流动相为乙腈-水（50 ∶ 50，V/V），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。采用建立的方法测定不同产地（陕西商洛、陕西安康、河南内乡、云南宣威、四川德阳、湖北十堰、湖南张家界、湖南常德）野生黄姜中薯蓣皂苷的含量，并比较其差异。结果：薯蓣皂苷检测质量浓度线性范围为4.16～165.6 μg/mL（r=0.999 9），精密度、重复性、稳定性试验的RSD均<2%（n=5或n=6），薯蓣皂苷平均回收率为101.18%（RSD=1.27%，n=6）。不同产地野生黄姜中薯蓣皂苷含量由高到低依次为四川德阳（1 405.36 μg/g）>陕西商洛（1 201.79 μg/g）>湖南张家界（1 035.18 μg/g）>陕西安康（632.64 μg/g）>湖南常德（598.64 μg/g）>云南宣威（425.34 μg/g）>河南内乡（350.13 μg/g）>湖北十堰（338.39 μg/g）。结论：该法操作简便、准确，可用于黄姜中薯蓣皂苷含量的测定；不同产地野生黄姜中薯蓣皂苷含量差异明显，其中四川德阳产地的薯蓣皂苷含量最高。
　　关键词 黄姜；不同产地；薯蓣皂苷；含量比较；高效液相色谱法
　　Comparison of Diosgenin Content in Wild Dioscorea zingiberensis from Different Habitats
　　BAI Qiao，LIU Zhenzhen，XU Hao（School of Bioscience and Engineering，Shaanxi University of Technology，Shaanxi Hanzhong 723000，China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of diosgenin in Dioscorea zingiberensis，and to compare the contents of diosgenin in wild D. zingiberensis from different habitats. METHODS：HPLC method was adopted. The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （50 ∶ 50，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. The detection wavelength was set at 203 nm，and sample size was 10 μL. Established method was used to determine the contents of diosgenin in wild D. zingiberensis from different habitats （Shaanxi Shangluo，Shaanxi Ankang，Henan Neixiang，Yunnan Xuanwei，Sichuan Deyang，Hubei Shiyan，Hunan Zhangjiajie，Hunan Changde）. The differences of diosgenin content were compared. RESULTS：The linear range of diosgenin were 4.16-165.6 μg/mL （r= 0.999 9）. RSDs of precision，reproducible and stability tests were all lower than 2% （n=5 or n=6）. The average recovery of diosgenin was 101.18% （RSD=1.27%，n=6）. The content of diosgenin in wild D. zingiberensis from different habitats were in descending order，i.e. Sichuan Deyang （1 405.36 μg/g）>Shaanxi Shangluo （1 201.79 μg/g）>Hunan Zhangjiajie （1 035.18 μg/g）>Shaanxi Ankang （632.64 μg/g）>Hunan Changde （598.64 μg/g）>Yunnan Xuanwei （425.34 μg/g）>Henan Neixiang （350.13 μg/g）>Hubei Shiyan （338.39 μg/g）. CONCLUSIONS：Established method is simple，accurate and suitable for the content determination of diosgenin in D. zingiberensis. The contents of diosgenin in wild D. zingiberensis from different habitats are different significantly，and the content of diosgenin in the samples from Sichuan Deyang is the highest. 　　KEYWORDS Dioscorea zingiberensis； Different habitats； Diosgenin； Content comparison； HPLC
　　黄姜又称盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）、火头根，是薯蓣科薯蓣属多年生缠绕性藤本植物，是我国特有种[1-2]。黄姜分布范围较广，生态环境对其形态性状与活性成分积累等方面影响显著[3-6]。黄姜以其根状茎入药，民间将其捣烂用于治疗各种外科炎症，如皮肤急性化脓性感染、蜂哲、虫咬等[7]。中医学认为其味甘、苦、凉，具有祛痰、消食利水、舒筋活血以及败火的功效[8]。由于市场上对薯蓣资源的需求增加，但又缺乏科学计划性的采挖，使得野生盾叶薯蓣资源量急剧下降[9-10]。
　　黄姜主要活性成分薯蓣皂苷为甾体皂苷类，具有祛痰、脱敏、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降压、降血脂、改善动脉粥样硬化、保护血管内皮功能、抑制肝脏纤维化等作用，也是合成甾体激素和口服避孕药的原料[11-15]。薯蓣皂苷在黄姜中含量较高，是筛选优良野生黄姜品种的首要物质基础[16]。本研究建立高效液相色谱（HPLC）法测定黄姜中薯蓣皂苷的含量，并对不同产地（陕西商洛、陕西安康、河南内乡、云南宣威、四川德阳、湖北十堰、湖南张家界、湖南常德）野生黄姜中薯蓣皂苷含量进行比较，为筛选高含量薯蓣皂苷的野生黄姜及其良种选育与栽培提供一定的数据基础。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　1260 HPLC仪（美国安捷伦有限公司，配有DAD检测器）；JJ224BC电子分析天平（常熟市双杰测试仪器厂）；HC-300Y2中药材粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）；DHC-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；UPH-I-5/10/20T超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　陕西商洛、陕西安康、河南内乡、云南宣威、四川德阳、湖北十堰、湖南张家界、湖南常德野生黄姜于2017年10月采集（随机采样法[17]采集），经陕西理工大学徐皓副教授鉴定为黄姜根茎；薯蓣皂苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21176，纯度：≥98%）；乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯，水为超纯水。不同产地野生黄姜的基本信息见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱为Inertsil ODS-3（150 nm×4.6 nm，5 μm）；流动相为乙腈-水（50 ∶ 50，V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为203 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 薯蓣皂苷对照品溶液 精密称取薯蓣皂苷对照品6.90 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，配制成质量浓度为0.276 mg/mL的薯蓣皂苷对照品溶液，再经0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。
　　2.2.2 供试品溶液 取湖南张家界野生黄姜样品，洗净，切片，60 ℃烘干后，粉碎过60目筛，精确称取粉末0.28 g，置于具塞锥形瓶中，加入60%的乙醇溶液25 mL，称质量，超声（功率：100 W，频率：50 Hz）处理40 min后，放置至室温，再次称质量，用60%乙醇溶液补足减失质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
　　2.3 系统适用性试验
　　取“2.2”项下薯蓣皂苷对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，薯蓣皂苷出峰处未见其他干扰峰，且与相邻峰分离度大于1.5，理论板数以薯蓣皂苷峰计大于5 000。色谱图见图1。
　　2.4 线性关系考察
　　精密吸取“2.2.1”项下的薯蓣皂苷对照品溶液适量，制成质量浓度为4.16、13.8、27.6、88.2、110.4、165.6 μg/mL系列溶液，精密量取10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以薯蓣皂苷峰面积为纵坐标（y）、薯蓣皂苷质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得线性回归方程为y=2.967 6x+8.662 8（r=0.999 9）。结果，薯蓣皂苷在4.16～165.6 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。
　　2.5 精密度试验
　　取“2.4”项下制成的质量浓度为27.6 μg/mL的薯蓣皂苷对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，并计算峰面积RSD。结果，薯蓣皂苷峰面积的RSD为0.40%（n=6），表明仪器精密度良好。
　　2.6 稳定性试验
　　取陕西商洛野生黄姜样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下，分别放置0、2、4、6、8 h后按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，薯蓣皂苷峰面积的RSD为0.73%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
　　2.7 重复性试验
　　取陕西安康野生黄姜样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，薯蓣皂苷峰面积的RSD为1.02%（n=6），表明本试验方法重复性良好。
　　2.8 加样回收率试验
　　精密称取已知含量的湖南张家界野生黄姜样品粉末0.28 g，平行6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液。再取5 mL的供试品溶液与1 mL“2.4”项下制成的质量浓度为88.2 μg/mL薯蓣皂苷对照品溶液混合，定容至10 mL量瓶中，过滤，取续滤液按“2.1”項下色谱条件进样测定。结果，薯蓣皂苷平均回收率为101.18%，RSD为1.27%（n=6）。
　　2.9 样品含量测定
　　取陕西商洛、陕西安康、河南内乡、云南宣威、四川德阳、湖北十堰、湖南张家界、湖南常德野生黄姜样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每个产地平行制备3批，按照“2.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积并计算薯蓣皂苷含量。结果，陕西商洛、陕西安康、河南内乡、云南宣威、四川德阳、湖北十堰、湖南张家界、湖南常德野生黄姜中薯蓣皂苷的含量分别为1 201.79、632.64、350.13、425.34、1 405.36、338.39、1 035.18、598.64 μg/g，详见表3。 　　3 讨论
　　3.1 流动相的选择
　　盾叶薯蓣中甾体皂苷类成分种类多、结构相似，且均处于末端吸收，分离难度较大[11]。笔者考察了流动相中乙腈与水的体积比分别为40 ∶ 60、45 ∶ 55、50 ∶ 50、55 ∶ 45、60 ∶ 40时，对薯蓣皂苷峰形的影响，结果表明，当乙腈与水的体积比为50 ∶ 50时，薯蓣皂苷峰形及分离度较好，灵敏度高，故在本试验中采用该体积比。
　　3.2 提取溶剂的选择
　　笔者在前期试验中以50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%乙醇溶液以及无水乙醇和甲醇为提取溶液，结果发现，以60%乙醇为提取溶液时，所测得的薯蓣皂苷峰面积最大，且杂峰少。
　　3.3 不同产地黄姜中薯蓣皂苷含量差异分析
　　现有文献多是报道某个省份黄姜品种的品质，均不能准确体现出全国不同省份黄姜的品质[18-26]。由于野生品种分布范围广且不集中，本试验的样品采自6个省份，且为了准确分析不同产地黄姜的品质差异，采用随机采样法进行样品收集。同时，本试验建立的含量测定方法操作简便准确，精密度、稳定性、重复性好，可用于黄姜的有效药用成分薯蓣皂苷的测定。结果表明，8个野生黄姜样品中薯蓣皂苷含量差异较为明显，薯蓣皂苷含量由高到低依次为四川德阳（1 405.36 μg/g）>陕西商洛（1 201.79 μg/g）>湖南张家界（1 035.18 μg/g）>陕西安康（632.64 μg/g）>湖南常德（598.64 μg/g）>云南宣威（425.34 μg/g）>河南内乡（350.13 μg/g）>湖北十堰（338.39 μg/g）。
　　综上所述，本研究建立了HPLC法测定黄姜中薯蓣皂苷的含量，并比较了8个不同产地野生黄姜样品中薯蓣皂苷含量差异，可为黄姜药材良种选育与栽培提供一定的数据基础。
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　　（收稿日期：2018-09-11 修回日期：2018-12-31）
　　（编辑：唐晓莲）
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