里氏木霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶的研究

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　　摘要 [目的]探讨利用稻草秸秆作为碳源固态发酵产β-葡萄糖苷酶的条件。[方法]以碱预处理的稻草秸秆作为碳源，确定里氏木霉固态发酵的优化条件，使用发酵生产的酶制剂对稻草进行酶解反应。[结果]在采用酵母提取物作为氮源、固液比1.0∶2.0（g∶mL）、温度28 ℃、初始pH 5.5、吐温-80浓度为0.2%和发酵时间为96 h时，菌株固态发酵的产酶条件最优。在此发酵工艺条件下，β-葡萄糖苷酶活力为8.9 U/mL。利用试验所产酶制剂对稻草进行水解，酶解得率为68.2%。[结论]该研究为里氏木霉固态发酵生产β-葡萄糖苷酶和酶解稻草的应用提供了一定的依据。
　　关键词 β-葡萄糖苷酶;固态发酵;里氏木霉;稻草酶解
　　Abstract [Objective]To study  the conditions of βglucosidase production by solidstate fermentation using rice straw as carbon source.[Method]The alkalipretreated rice straw was used as the carbon source， the optimal conditions for solid state fermentation of Trichoderma reesei were determined， the enzyme preparation produced by fermentation was used for enzymatic hydrolysis of rice straw.[Result]The optimal conditions were as follows： yeast extract was used as the nitrogen source， solidliquid ratio was 1.0∶2.0（g∶mL）， temperature was 28 ℃， initial pH was 5.5， Tween 80 concentration was 0.2% and fermentation time was 96 h. Under those fermentation condition， βglucosidase activity was 8.9 U/mL. The enzyme produced by the experiment was used to hydrolyze the rice straw， and the enzymatic hydrolysis yield was 68.2%.[Conclusion]The study provided a certain basis of application of solid state fermentation for βglucosidase production by T. reesei and enzymatic hydrolysis of rice straw.
　　Key words βglucosidase;Solid state fermentation;Trichoderma reesei;Enzymatic hydrolysis of rice straw
　　β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是能夠特异性地催化低聚糖、芳香基和烃基末端非还原性β-D-葡萄糖苷键的水解，从而释放β-D-葡萄糖和相应配基的糖苷水解酶类的总称。β-葡萄糖苷酶最早从苦杏仁汁中被发现，并能催化水解龙胆二糖和纤维二糖，故别名苦杏仁苷酶、龙胆二糖酶和纤维二糖酶。β-葡萄糖苷酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内，对维持生物的生理功能起重要作用[1-3]。在纤维素降解过程中，β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶系中的重要组成成分，能够水解纤维寡糖中末端非还原性的β-D-葡萄糖键，最终与内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶一起将纤维素水解为葡萄糖[4-6]。
　　纤维素是世界上最丰富的可再生有机资源，其年产量高达千亿吨以上。将稻草、玉米秸秆、玉米芯、麦秆和棉花秆等含纤维素的各类农林副产物进行降解利用，进而发酵生产各类生物化工品，这对于农林资源的利用和环境保护具有重大的意义[7-8]。该研究以稻草秸秆为发酵碳源，用固态发酵法对里氏木霉产β-葡萄糖苷酶进行发酵条件的研究，并利用所产β-葡萄糖苷酶对稻草秸秆进行水解糖化，从而为稻草秸秆的高效转化提供理论参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　菌株：里氏木霉H7为实验室保存。
　　稻草采自浙江省嘉兴市嘉善县，烘干后密封冷藏保存。化学试剂均为国产分析纯。
　　PDA培养基：称取PDA干粉（英国Oxoid公司CM0139）39 g，加入 1 L去离子水，搅拌至样品分散，高压蒸汽灭菌后倾注平板。
　　固态产酶培养基：葡萄糖2 g，稻草8 g，酵母提取物1.5 g，（NH4）2SO4 0.25 g，MgSO4 0.05 g，CaCl2 0.03 g，KH2PO4 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.2 mg，MnSO4·H2O 0.1 mg，ZnSO4·7H2O 0.1 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg。其中稻草经过碱预处理。
　　1.2 方法
　　1.2.1 稻草预处理。稻草秸秆剪至2 cm左右，与2%氢氧化钠溶液混合，常压37 ℃放置处理24 h，再高压105 ℃条件下反应50 min。反应完后用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗3次，烘干后密封冷藏保存。
　　1.2.2 固态发酵。在PDA平板上培养里氏木霉120 h，用生理盐水洗下孢子，离心去上清，用无菌水调节孢子浓度至108个/mL，取2 mL孢子液接入固态产酶培养基，每24 h翻动一次，调整固态发酵的条件（氮源、固液比、温度、初始pH、吐温-80浓度和发酵时间）。 　　1.2.3 粗酶液的制备。将发酵得到的固态酶制剂2 g加入到100 mL无菌生理盐水中，振荡提取30 min，离心收集上清液即为粗酶液。
　　1.2.4 酶活测定。β-葡萄糖苷酶活（BGA）：用纤维二糖溶液与酶液在50 ℃水浴反应30 min后，葡萄糖氧化酶法测葡萄糖。1 g固体酶（或1 mL酶液）1 h水解底物纤维二糖，产生出1.0 mg葡萄糖所需的酶量，为1个β-葡萄糖苷酶活力单位，用U/g（或U/mL）表示。
　　滤纸酶活力（FPA）：取1 cm×6 cm 滤纸（Whatman No.1）与酶液在50 ℃水浴反应30 min后，DNS法测还原糖。1 h产1.0 mg还原糖所需的酶量为1个滤纸酶活单位，用U/g（或U/mL）表示。
　　1.2.5 稻草酶解试验。取1 g碱处理后的稻草残渣，加入pH 4.8柠檬酸缓冲液配制的纤维素酶液，放入恒温水浴振荡器，在50 ℃、100 r/min的条件下反应50 h，通过DNS法测定酶解反应液中的还原糖。纤维素酶用酶量分别为100、200和300 U（FPA）的酶液。酶解得率=还原糖总量（g）×0.9×100%/0.658 g，其中 0.658 g为每克底物中纤维素和半纤维素的质量。
　　2 结果与分析
　　2.1 氮源对里氏木霉产酶的影响
　　氮源的主要作用为合成菌体物质和含氮代谢物。分别采用玉米浆粉、酵母提取物、蛋白胨、黄豆饼粉、硝酸钠和硫酸铵作为氮源，试验结果显示，菌体对有机氮源和无机氮源都能够利用，但利用有机氮源的效果好于无机氮源，其中以酵母提取物发酵酶活最高。因此，选择酵母提取物作为氮源。
　　2.2 固液比对里氏木霉产酶的影响
　　改变培养基的固液比进行发酵产酶，其结果如图2所示。固液比对木霉产酶的影响是显著的，在一定范围内，随固液比的增加，发酵酶活表现为先增加后降低的趋势。固液比过高时，由于菌体生长和产酶所需的水分太少，影响了酶的产生;固液比过低时，由于营养物质的浓度降低和透气性下降影响了菌体的生长和产酶。当固液比为1.0∶2.0（g∶mL）时，里氏木霉所产酶活力最高，因此后续试验采用固液比为1.0∶2.0。
　　2.3 温度对里氏木霉产酶的影响
　　最适温度范围内，菌体生长速率随着温度的上升而增加;当超过最适生长温度时，菌体生长速率随着温度的上升而急剧下降。发酵温度影响里氏木霉菌体的生长和酶的合成。采用22、24、26、28、30和32 ℃ 进行试验，结果显示（图3）当发酵温度为28 ℃时里氏木霉所产酶活力最高，因此后续试验采用发酵温度为28 ℃。
　　2.4 初始pH对里氏木霉产酶的影响
　　培养基的初始pH对菌体生长和产物合成有很大的影响，一方面通过调节细胞膜的通透性和酶的活性影响菌体的新陈代谢，另一方面也影响培养基组分的解离，进而影响菌对营养成分的吸收。采用不同的初始pH进行发酵试验，结果显示（图4）当初始pH为5.5 时里氏木霉所产酶活力最高，因此后续试验采用初始pH为5.5。
　　2.5 吐温-80对里氏木霉产酶的影响
　　表面活性剂能够提高微生物细胞膜的通透性，促进细胞內酶的外分泌和细胞外营养物质的吸收，添加适量的表面活性剂能够提高酶活力。采用不同浓度的吐温-80进行发酵试验，结果显示（图5）当吐温-80浓度为0.2%时里氏木霉所产酶活力最高，高于0.2%的吐温-80对木霉产酶有抑制作用，因此后续试验采用吐温-80浓度为0.2%。
　　2.6 培养时间对里氏木霉产酶的影响
　　将里氏木霉进行固态发酵产酶，每24 h取样测酶活，结果如图6所示。试验发现24 h后见少量白色菌丝，前24 h 酶活上升比较缓慢，48 h后酶活上升较快，到发酵96 h时β-葡萄糖苷酶活最高（8.9 U/mL），在96 h后能见到绿色孢子，说明培养基营养已经基本耗尽，菌种进入了产孢期，此后酶活则开始下降。
　　2.7 酶解试验
　　以稻草纤维残渣为原料，采用里氏木霉H7的纤维素酶和商品纤维素酶进行水解糖化，结果表明（表1）使用该试验固态发酵的酶制剂来水解稻草纤维残渣的酶解得率可达68.2%，水解稻草纤维残渣的效果介于2种商品酶制剂之间，与商品酶对比，该酶有一定的竞争力。
　　3 结论
　　里氏木霉是目前工业上重要的产酶菌种，能分泌组分较全的木质纤维素酶系[9-12]。稻草秸秆资源在我国极其丰富，价格低廉，成分主要为纤维素和半纤维素，利用碱预处理后的稻草作为发酵碳源能够降低原料成本[13-14]。该研究发现，以碱预处理的稻草作为碳源，利用里氏木霉固态发酵产β-葡萄糖苷酶的优化条件是：适宜的氮源为酵母提取物，固液比为1.0∶2.0（g∶mL），发酵温度为28 ℃，初始pH为5.5，吐温-80 浓度为0.2%，适合的发酵时间是96 h。在此发酵工艺条件下，β-葡萄糖苷酶活力为8.9 U/mL。利用试验所产酶制剂对稻草进行水解，酶解得率为68.2%。
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