一株产木聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

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　　摘要 从土壤中筛选出一株高产木聚糖酶的菌株ZK2，结合形态学以及16S rDNA 序列同源性分析对菌株进行鉴定，并对菌株的产酶条件进行优化。结果表明，菌株与枯草芽孢杆菌的相似度最高，在温度38 ℃、初始pH 8.0、发酵时间54 h、接种量10%时，菌株的产酶条件最优。
　　关键词 木聚糖酶；枯草芽孢杆菌；筛选；发酵条件
　　中图分类号 Q814.1 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）08-0168-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.044
　　Abstract A strain ZK2 with producing xylanase ability was isolated from the soil in Wuhan，Hubei Province.Strain ZK2 was identified based on physiological and sequence homology analysis of 16S rDNA sequence.Single factor experiments such as temperature，initial pH，fermentation period，inoculum size，were preliminarily optimized.The results showed that the strain had high similarity to the sequence of Bacillus subtilis.The optimum conditions for xylanase production were as follows：the optimal fermentation temperature of 38 ℃，initial pH of 8.0，fermentation period of 54 h，inoculum size of 10%.
　　Key words Xylanase；Bacillus subtilis；Screening；Fermentation conditions
　　木聚糖（xylan）为多聚五碳糖，是主要存在于植物细胞壁中的半纤维素成分，也是除纤维素外自然界中含量最丰富的可再生多糖[1-2]。木聚糖虽然广泛存在于植物体内，但动物基本不能消化吸收。木聚糖酶（DxylanxylanohydrolaseEC3.2.1.8）是一类木聚糖降解酶系，属于水解酶类[3]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成，其中木聚糖酶（β-1，4-D-xylanase）是最关键的水解酶，以内切方式作用于木聚糖主链内部的 β-1，4-木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖和少量木糖[4]，为木聚糖的进一步应用起着极为重要的作用。
　　木聚糖酶具有重要的应用价值，在饲料[5]、造纸[6]、食品和医药[2-3]等行业均有广泛的应用。因此，对木聚糖酶的开发研究具有极大的商业价值。木聚糖酶主要来源于真菌、细菌、藻类和原生动物[7-9]，当前绝大多数商用木聚糖酶来源于真菌，主要由于真菌的产酶量相对较高。但真菌发酵周期长，且大部分真菌木聚糖酶最适作用条件偏于中性，使其在造纸、饲料、食品等工业极端环境下应用受到一定限制[10]，而细菌木聚糖酶在耐极端条件方面有较强的优势[10-13]，因此，从自然界中筛选细菌源的木聚糖酶仍具有极其重要的意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器 土样采自湖北省武汉市汤逊湖旁。酵母浸粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硝酸铵，均为分析纯，购自国药集团有限公司，木聚糖购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，琼脂购于Biosharp，Japan。
　　BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器、JY600 DNA电泳仪、HH-S6 恒温水浴锅、OHG-914385-III电热恒温鼓风干燥箱、TG16-WS 台式高速离心机、 SW-CJ-ZG超净工作台、Bio-rad MyCycler PCR仪、Spx-250b-d全温振蕩培养箱、722型紫外可见分光光度计。
　　1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏0.50%、蛋白胨1.00%、氯化钠0.50%、pH 7。
　　选择培养基：榉树木聚糖0.50%、硝酸铵0.30%、酵母浸粉0.40%、氯化钠0.50%、磷酸氢二钾0.20%、硫酸镁0.02%、琼脂2.00%、pH 7。发酵培养基：玉米芯粉3.00%、蛋白胨0.50%、磷酸氢二钾0.50%、pH 7。
　　1.3 产木聚糖酶菌株的分离与筛选
　　取100 mL蒸馏水加入装有玻璃珠的250 mL锥形瓶中，高压灭菌，将1 g土样加入锥形瓶中，振荡30 min，按 10 倍稀释法进行稀释，取土样稀释液10-4、10-5、10-6的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平皿中，30 ℃培养48 h。挑取单菌落，用牙签点样至选择培养基，并做好标记；于30 ℃培养48 h。培养后，用0.2%的刚果红染色20 min，用蒸馏水洗去染液，再用1 mol/L氯化钠洗脱10 min，观察有无透明圈，测量透明圈的直径D及菌斑的直径d，并计算D/d，挑选比值最大的菌株做后续研究。
　　1.4 产木聚糖酶菌株的鉴定
　　1.4.1 形态学鉴定。观察菌株的菌落特征，并挑取少许菌体做细胞染色，观察其形态特征。
　　1.4.2 菌株的16S rDNA 序列分析。
　　采用细菌通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ ）和1492R（5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）[14]扩增分离株的16S rDNA。PCR反应条件：首先预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测后回收，送至上海桑尼生物科技有限公司测序，序列通过NCBI的Blastn比对分析，并利用软件Mega 4构建系统进化树。 　　1.5 木聚糖酶活力的测定
　　1.5.1 木聚糖酶液的制备。
　　将菌株接种于发酵培养基，培养适当时间后，取适量于50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min，取上清液，即为粗酶液[15]。
　　1.5.2 木糖标准曲线制作。
　　配制1.0 μmol/mL的木糖标准溶液，分别取标准木糖溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL， 去离子水补足至2 mL，再加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，立即放冷水中冷却，定容至10 mL，用分光光度计测定 540 nm下的吸收值。以木糖含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制木糖标准曲线。
　　1.5.3 木聚糖酶活性的测定。
　　1.9 mL含1%木聚糖的底物，加入0.1 mL 适当稀释的酶液，30 ℃准确反应10 min后加入2 mL DNS溶液终止反应，沸水浴10 min，冷却后加水定容至10 mL，充分摇匀，以灭活酶液做对照，测量样品540 nm波长处的吸光度。
　　木聚糖酶活力的定义： 30 ℃条件下，1 mL粗酶液1 min水解木聚糖生成1 μmol还原糖（木糖）的酶量，称为1个酶活力单位，U/mL。
　　1.6 产木聚糖酶菌株的产酶条件优化
　　1.6.1 温度对酶活的影响。将菌株接种至发酵培养基中，初始pH 7、接种量为10%，温度分别为22、26、30、34、38、42 ℃，培养48 h，提取粗酶液，测定处理液的酶活。
　　1.6.2 初始pH对酶活的影响。
　　将菌株接种至发酵培养基中，温度为30 ℃，接种量为10%，pH分别为4、5、6、7、8、9，培养48 h，提取粗酶液，测定处理液的酶活。
　　1.6.3 发酵周期对酶活的影响。
　　将菌株接种至发酵培养基中，温度为30 ℃，接种量为10%，pH 7，发酵时间分别为18、30、42、54、66、78 h，提取粗酶液，测定处理液的酶活。
　　1.6.4 接种量对酶活的影响。将菌株接种至发酵培养基中，温度为30 ℃，pH 7，接种量分别为1%、5%、10%、15%、20%、25%，培养48 h，提取粗酶液，测定处理液的酶活。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株的分离与筛选
　　经过平板筛选，挑取能产生透明圈的菌株2株。由表1可知，菌株ZK2的产木聚糖酶活性较ZK5高，因此选取ZK2做后续试验。
　　2.2 菌株ZK2的形态学鉴定与分子生物学鉴定
　　2.2.1 菌株ZK2的形态鉴定。菌株ZK2 的菌落为白色、圆形，边缘光滑，菌落不透明。镜检发现菌体杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢（图1）。
　　2.2.2 菌株ZK2 16S rDNA的鉴定。以菌株ZK2基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，得到1.5 kb左右大小的条带（图2）。
　　16S rDNA比对结果表明，ZK2与枯草芽孢杆菌的相似性最高。从系统发育树看，ZK2与枯草芽孢杆菌聚为一簇，结合形态学、 16S rDNA序列分析，将菌株ZK2鉴定为枯草芽孢杆菌（图3）。
　　2.3 菌株ZK2产酶条件的优化
　　2.3.1 木糖标准曲线的制作。按“1.5.2”制作木糖标准曲线，结果见图4。
　　2.3.2 培养温度对酶活的影响。
　　由图5可知，产木聚糖酶的发酵培养最适温度为38 ℃，在该温度下发酵培养液产酶能力最好。在培养温度22～38 ℃时，酶活力随温度的升高而增加，温度高于38 ℃时，产酶能力开始下降。
　　2.3.3 初始pH对酶活的影响。由图6可知，产木聚糖酶的发酵初始培养 pH为 8.0 时，产酶能力最强，说明菌株ZK2最适宜在碱性环境下产木聚糖酶。
　　2.3.4 发酵周期对酶活的影响。
　　由图7可知，在发酵时间为18～54 h时，产酶能力逐渐增加，发酵时间为54 h时，产酶能力最强，菌株ZK2产木聚糖酶的最适发酵培养时间为54 h。
　　2.3.5 接种量对酶活的影响。
　　由图8可知，当接种量为15%时，产木聚糖酶菌株的产酶活力最高，接种量为0～15%时，酶活逐渐增加，当接种量大于15%后，酶活渐渐降低。由于接种量较大时，菌体生长过快，导致发酵液的黏度增加，在供氧量不变的情况下，会造成溶氧量不足而影响木聚糖酶的生成，因此最适接种量为10%。
　　3 结论与讨论
　　通过稀释涂平板，用透明圈法检测酶活的大小，从土壤中筛选出一株高产木聚糖酶菌株ZK2。对ZK2进行形态学鉴定以及分子生物学鉴定，通过16S rDNA比对，ZK2与枯草芽孢杆菌的相似性大于99%，鉴定ZK2为枯草芽孢杆菌。
　　对ZK2产酶条件进行初步优化，产酶条件在培养温度38 ℃、初始pH 8.0、接种量15%、发酵周期54 h时最优。刘程程等[1]筛选到的一株木聚糖酶高产菌株FJAT-14260（沙福芽孢杆菌 Bacillus safensis），最适培养温度為30 ℃，最适初始pH为7.0，与FJAT-14260相比，ZK2能耐受一定的碱性；易旭东等[11]从土壤中筛选出一株碱性木聚糖酶产生菌株 YH158，培养基初始 pH 8.0产酶活性较高，为碱性酶；真菌产木聚糖酶活性较细菌高，但真菌来源的木聚糖酶一般为酸性酶[16]，碱性木聚糖酶的开发利用具有广泛的应用前景。
　　目前，我国对木聚糖酶的需求日益增高，碱性木聚糖酶可应用于纺织业、造纸业等，该研究筛选到的产木聚糖酶菌株ZK2，与一些产木聚糖酶菌株相比，有较高的耐碱性，具有一定的应用开发价值。
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