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去甲斑蝥素钠小鼠体内组织分布研究

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  【摘要】本文建立快速灵敏的HPLC-MS/M方法测定血浆和组织中去甲斑蝥素钠的浓度,研究去甲斑蝥素钠小鼠体内组织分布。
  【关键词】去甲斑蝥素钠 体内组织 分布
  1实验方法
  1.1仪器与试药
  仪器Agilent 1200 Series/6410 Series HPLC/MS/MS高效液相色譜/质谱仪(安捷伦科学技术公司);梅特勒-托利多AX -205电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);PROIND离心机(贺立氏);XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司);PK514BP超声清洗器(德国BANDEL),BHW-IV型电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)。
  药品 去甲斑蝥素钠,实验室自制,纯度99.4%;去甲斑蝥素标准品由山东莒南制药厂提供;利巴韦林标准品(纯度),中国药品生物制品检定所。
  试剂乙腈,批号501287;乙酸铵,批号110020;甲酸,批号406014;丙酮,批号405160均为色谱纯,美国TEDIA COMPANY,INC生产。
  标准溶液的制备 去甲斑蝥素钠和利巴韦林储备液及标准系列的配制同前。
  1.2实验动物
  昆明种小白鼠,体重25±2克,雌雄各半,购于山东大学实验动物中心。
  1.3实验设计
  于给药后0.25,1,2,4,8 h经摘眼球取血后脱颈处死小鼠,取出心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、胃、睾丸/子宫,组织用生理盐水冲洗干净后用滤纸吸干,-20℃保存待测。
  1.4样本分析
  色谱条件C18色谱柱(150×4.6 mm,5 (m);流动相乙腈-水(20:80,2 mM乙酸铵,含0.1%甲酸);在线脱气,流速1.0 mL·min-1;柱温25℃;进样量10μL。
  质谱条件 AP-ESI离子源,正离子模式,干燥气(N2)流速12.0 L·min-1,干燥气压力50 psi,干燥气温度为350℃,毛细管电压4000 V,多级反应监测(MRM)模式,选择性离子对(M/Z)为169→123(去甲斑蝥素钠)和267.1→135.1(内标利巴韦林),碎片电压分别为120 V和170 V,碰撞能分别为5 eV和13eV。
  组织样品处理 取动物脏器,精密称重,剪碎后按2 mL·g-1比例加入生理盐水,冰浴条件下用组织匀浆机进行匀浆。取组织匀浆液0.3 mL,置离心管中,加10 (g·mL-1利巴韦林溶液30 (L(心、脾、脑组织加1 (g·mL-1利巴韦林溶液30 (L),涡旋30秒,加入100 (L 1MHCl,涡旋30秒,然后加入1 mL丙酮涡旋1 min,5000r·min-1离心10 min,取上清液1 mL置离心管中,40℃氮气吹干,残留物用100 (L水复溶,取10 (L进样测定。
  1.5数据处理
  组织分布参数计算根据计算得到的组织中药物浓度-时间数据,计算药时曲线下面积AUC,MRT,结合Cmax、Tmax等参数考察药物在体内组织分布情况及动力学过程。
  2结果
  2.1组织称重及处理
  将给药后0.25,1,2,4,8 h采集的组织样本经生理盐水冲洗,滤纸吸干后用电子天平精密称量,称重原始数据。
  2.2小鼠组织中去甲斑蝥素钠浓度-时间数据
  根据HPLC-MS/MS法测定得到的组织中去甲斑蝥素钠的浓度和精密称量的组织重量,计算每克组织中药物含量(μg·g-1)=C测×V/W称,其中C测为测定得到组织匀浆中去甲斑蝥素钠浓度(μg·mL-1);V为所加生理盐水体积(mL);W称为组织重量。
  由结果看出,小鼠灌胃给予去甲斑蝥素钠溶液后,在各组织中分布广泛,给药后不同时间点各组织中药物浓度依次为:0.25h,小肠>子宫>胃>肾>睾丸>肝>肺>心>脾>脑;1h,胃>小肠>子宫>肾>肝>睾丸>肺>心>脾>脑;2h,小肠>胃>子宫>肾>睾丸>肝>脾>肺>心>脑;4h,肾>小肠>肝>子宫>胃>睾丸>肺>心>脾>脑;8 h,小肠>子宫>胃>肝>睾丸>肾>肺>脾>心>脑。
  2.3组织中药物浓度-时间分布图
  根据各组织平均浓度-时间数据绘制组织中药物浓度-时间分布图。
  由结果可知,除脾脏是1 h达峰外,去甲斑蝥素钠在其他组织均在15 min达到最高浓度,然后随时间逐渐降低;给药后4 h,在心、肝、肺、肾的浓度再次升高,随后降低;而脑、胃、睾丸、子宫随时间浓度逐渐降低。
  去甲斑蝥素钠在肠、胃和子宫的分布最高,肾和睾丸次之,在心、肝、脾和肺的分布较低,脑中药物量极低。
  2.4组织药-时曲线下面积和平均滞留时间数据
  根据DAS 2.0计算小鼠灌服去甲斑蝥素钠溶液后各组织药-时曲线下面积(AUC)和平均滞留时间(MRT),以AUC为指标进一步分析去甲斑蝥素钠在小鼠组织的分布,以MRT为指标分析去甲斑蝥素钠在小鼠组织的消除情况。
  由结果可知,给药后各组织药时曲线下面积依次为:小肠>胃>子宫>肾>睾丸>肝>肺>脾>心>脑。给药后各组织体内平均滞留时间依次为:肺>肝>睾丸>脑>脾>肾>子宫>心>胃>小肠。
  3讨论
  给药后各组织药时曲线下面积依次为:小肠>胃>子宫>肾>睾丸>肝>肺>脾>心>脑。给药后各组织体内平均滞留时间依次为:肺>肝>睾丸>脑>脾>肾>子宫>心>胃>小肠。由此可以看出,去甲斑蝥素钠在胃、小肠等消化道组织中分布最高,为其在消化道癌症的临床应用提供药动学理论依据;其次,子宫中去甲斑蝥素钠的分布较多,体外实验证实去甲斑蝥素对宫颈癌(HeLa)具有较强的抗癌作用,但临床在子宫癌或宫颈癌的应用较少,可以此为理论基础增加其临床适应症;去甲斑蝥素钠在肾中的分布仍较高,临床表现为泌尿系统刺激性;去甲斑蝥素钠在临床主要用于肝癌的治疗,但实验结果表明肝中去甲斑蝥素钠的浓度较低;药物在睾丸、肺、脾、心和脑的分布较低,特别是脑组织中的浓度极低,说明其不易透过血脑屏障,与其极性大、脂溶性低有关。
  给药后各组织体内平均滞留时间依次为:肺>肝>睾丸>脑>脾>肾>子宫>心>胃>小肠,其在肺和肝中的滞留时间较长,消除比较慢,可以增强药物的疗效,因此临床常用于肝癌的治疗。
  从两项结果可以看出,去甲斑蝥素钠在分布较高组织滞留时间较短,分布较低的组织滞留时间较长,决定其在临床上作用广泛。
  参考文献:
  [1]董成.3H-去甲基斑蝥素在小鼠体内分布的研究[J].江西医学院学报,1984(1):24-25.
  [2]魏春敏,王本杰,马娅等.3H-去甲斑蝥素小鼠体内药代动力学与组织分布[J]. 药学学报,2007,42(5):516–519.
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