细辛脂素联合受体脾细胞诱导心脏移植免疫耐受的研究
来源:用户上传
作者: 张丽丽 王晓云 陈延军 李学奇 李刚 李述峰 聂宏刚 王蕊 李天发 满迎春 苑可心 张烁
【摘要】目的：本实验通过术前7日和术前3日输注不同剂量供者脾细胞于受体胸腺内，联合中药细辛中的细辛脂素成分，探讨其对心脏移植免疫耐受的诱导，并对诱导效果加以比较。方法：提取中药细辛中的细辛脂素成分。健康雄性Wistar大鼠（供体）和SD大鼠（受体）各80只随机配对，建立大鼠腹部异位心脏移植模型，将接受心脏移植的SD大鼠分成5组：A组：阳性对照组，行腹部异位心脏移植，不给任何处置；B组：细辛脂素组：行腹部异位心脏移植，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1；C组：脾细胞诱导组1，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内；D组：脾细胞诱导组2，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1；E组：脾细胞诱导组3，术前3天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1。每组各8只术后第7天处死。另外8只用于观察移植物生存天数。噻唑蓝（MTT）法检测供受体混合淋巴细胞反应；应用ELISA法检测受体血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平； 结果：1、免疫诱导组联合细辛脂素组（D组和F组）移植心存活时间较阳性对照组显著延长（P<0.01）。2、供受体混合淋巴细胞反应免疫诱导组较阳性对照组差异有显著性（P<0.01）。3、免疫诱导组联合细辛脂素组（D组和F组）移植物生存时间和外周血细胞因子均有显著性差异（P<0.05）。结 论：1、通过术前7日胸腺内输注脾细胞可以诱导心脏移植免疫耐受，为供者特异性免疫耐受。2、术前7日预处理对心脏移植免疫耐受的诱导较术前3日预处理组理想。
【关键词】细辛脂素;心脏移植;脾细胞;细胞因子;免疫耐受
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455（2011）12-0019-02
The Induction of Immune Tolerance in Rats Cardiac Allograft by Asarinin Combined with splenocyte
Zhang Lili Wang Xiaoyun Chen Yanjun1 et al.
【Abstract】Objective: To study the effect of immune tolerance in rats cardiac allograft induced by donor splenocyte 7 days and 1day before operation combined with Asarinin. Methods: To extract the asarinin from herba asari. The 80 SD rats （receptor） and 64 wistar rats （donor） were divided into five groups: group A （control group）; group B （Asarinin treated 7 days before operation）; group C （splenocyte treated 7 days before operation）; group D （splenocyte treated 7 days before operation and Asarinin）; group E （splenocyte treated 3 days before operation and Asarinin）.Some were to examine survival time（n 8） and others were to observe mixed lymphocyte reaction（MLR） between the donor and receptor with MTT; the level of IL-2,IFN-γ,IL-4 and IL-10 in serum with ELISA postoperatively 7 days （n 8）. Result: 1.Allografts survival time is prolonged in group D and E （P<0.01）. 2.The lymphocyte proliferation is alleviated in group D and E comapred with group A（P<0.01）. 3.The level of IL-4 and IL-10 significantly increases in group D and E compared with group A （P<0.01）. Conclusion: 1. Immune tolerance can be induced by donor splenocyte 7days before operation and is specific tolerance to donor. 2. Immune tolerance induced by 7 days is better.
【Key words】Asarinin; Cardiac allograft; Splenocyte Cytokine; Immune tolerance
为了提高器官移植术的成功率，目前国内外很多学者致力于开发新型的免疫抑制剂和免疫耐受诱导的研究，但目前在器官移植方面还未有把中药免疫抑制剂与免疫耐受诱导联合应用的报道。因此，本研究的目的在于通过输注供者脾细胞于受体胸腺内，联合中药细辛中的细辛脂素成分，探讨不同预处理策略对心脏移植免疫耐受的诱导，并对诱导效果加以比较。
1 材料与方法
1.1 细辛脂素的分离提取和鉴定〖1〗:取产自黑龙江的中药材辽细辛，购自黑龙江省中药联营公司，鉴定师黑龙江省中医药大学王栋教授。采用常用的方法提取中药细辛中的细辛脂素成分，经鉴定细辛脂素纯度达95%以上，将提取的细辛脂素与橄榄油以500mg/100ml比例配成悬浊液。
1.2 大鼠腹部异位心脏移动物模型和免疫耐受诱导模型制备
1.2.1 实验动物:受体大鼠 健康雄性SD系大鼠 ，体重200－250g，供体大鼠 健康雄性Wistar系大鼠，体重150－200g。由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。
采用大鼠的同种异体腹部异位心脏移植术。供、受体均为无菌手术。供心的主动脉和肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静行端侧吻合。
1.2.2 主要试剂和试剂盒:高钾停跳液：哈医大二院心外科提供。
供心保存平衡液：林格氏液。
CsA：新山地明（瑞士山德士药厂生产）生理盐水稀释成1mg/ml，4℃保存备用。
噻唑蓝（MTT）：购自美国Sigma公司。
试剂盒：IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA检测试剂盒购自深圳晶美公司。按试剂盒说明操作。
1.2.3 供体脾细胞悬液的制备方法:取Wistar大鼠80只，与SD大鼠80只随机配对。
移植前7天，Wistar大鼠用1%戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉后，小心推开肠管，无菌切除脾脏。然后将脾脏置于放有冰块的平皿内，去掉被膜，将脾脏剪碎成匀浆状，剪碎后的脾组织匀浆用Tris-NH4Cl溶解红细胞，再用Hanks液洗涤3次，200目钢网过滤，制成脾细胞悬液。用RPMI1640液调细胞浓度为2.5×107ml-1。台盼兰拒染法判断细胞活性大于95%。37℃ 5% CO2条件下培养。
移植前7天，取配对SD大鼠，用1%戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉，颈胸部纵切口，显露胸腺，用微量进样器（针头直径0.32mm）将供者特异性抗原细胞一次性均匀注入配对C组和D组受体SD大鼠的胸腺两侧。移植前3天，将供者特异性脾细胞注入E组配对受体的胸腺两侧。剩余脾细胞继续培养。
1.2.4 术后处理和分组:术后40℃恒温箱保温6小时。大鼠于术后2小时左右清醒。术后1-2日用5%葡萄糖盐水喂养，以后改为正常饲养。每日腹部触诊检查移植心状态。术后第3日将移植存活良好（搏动有力，心率180-250次/分，心律规整）的大鼠进入各实验组，手术成功率为98%，全部手术均由两个术者配合完成。供体Wistar大鼠，受体SD大鼠，全部动物共分5组：
A组：阳性对照组，行腹部异位心脏移植，不给任何处置；
B组：细辛脂素组，行腹部异位心脏移植，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1；
C组：脾细胞诱导组1，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内；
D组：脾细胞诱导组2，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1；
E组：脾细胞诱导组3，术前3天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg・kg-1・d-1。
每组各8只术后第7天处死。另外8只用于观察移植物生存天数，以供心停跳当日作为排斥反应终点。
1.2.5 标本的采取:受体经戊巴比妥钠麻醉，常规固定、消毒、铺巾同前，切开腹壁，暴露下腔静脉。用无菌注射器经下腔静脉采血5ml，低温离心3000r/min无菌分离血清，分装后低温冰箱保存备测。手术取出脾脏,制成脾细胞悬液2.5×107/ml。
1.3 单向混合淋巴细胞培养:于术后7天进行，采用RPMI-1640培养液，加入配对供受体脾细胞悬液各0.1ml，另设E、F、G组加入无关Wistar大鼠脾细胞，于96孔板行混合淋巴细胞培养。Wistar大鼠脾细胞经丝裂霉素C（200？g/ml）处理30min，加样表如下,每个反应体系设三个复孔，应用MTT比色法检测脾细胞增殖程度。
1.4 检测指标
1.4.1 移植物生存天数观察。
1.4.2 单向混合淋巴细胞反应。
1.4.3 细胞因子检测：ELISA法检测受体外周血IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10。按试剂盒说明操作。
1.5 统计学处理:计量资料均以均数±标准差表示（x±s），样本均数的比较用t检验，以P>0.05为无显著性差异，以P<0.05为具有显著性差异，以P<0.01为具有极显著性差异。
2 实验结果
2.1 移植物生存天数:脾细胞诱导组2和脾细胞诱导组3移植物生存天数较阳性对照组明显延长（P<0.01），结果见表1。
Table1 Survival time of grafts in the receptor （d）
注：**与阳性对照组相比P<0.01
2.2 单向混合淋巴细胞反应:吸光度与脾细胞增殖程度成正比，各C、D、E免疫诱导组与阳性对照组OD值有显著性差异，各免疫诱导组脾细胞增殖程度明显降低（P<0.01）。脾细胞诱导组之间有显著性差异，以脾细胞诱导组2抑制效果最好（P<0.05）其刺激效应最低23%。各组吸光度值见表2。 MLR的刺激效应按照下列公式计算，结果见图1。刺激效应计算公式如下:
刺激效应（实验孔A值-对照孔A值）/对照孔A值×100%
Table 2: The result of MLR （OD×10-2）
注：*与A组相比P<0.05 **与A组相比P<0.01
2.3 外周血细胞因子检测结果:与阳性对照组相比，受体血清细胞因子脾细胞诱导组IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4、IL-10含量升高。结果见表3。
Table 3 The level of IL-2, IFN-γand IL-4 in serum（pg/ml）
注：*与阳性对照组相比P<0.05 **与阳性对照组相比P<0.01 Δ与脾细胞诱导组2相比P<0.05。
3 讨论
中药细辛中提取的细辛脂素具有一定的免疫抑制作用已得到证实〖2〗，并且发挥抗排异反应作用时可能与提高了免疫耐受有关，但它的抗排异反应作用弱于CsA。免疫耐受是指器官移植受者在不应用或停用免疫抑制剂的情况下，对移植的异体器官特异性地不产生免疫排斥或处于低反应状态而使其长期存活，它是以克隆无反应和免疫抑制等外周耐受机制为主。诱导耐受的方法分为中枢耐受和外周耐受。胸腺是重要的中枢免疫器官，又是一个“免疫特惠”器官，未成熟的T细胞在胸腺分化发育过程中，必须经过阳性选择和阴性选择才能分化发育成能与异物抗原发生反应的CD4+或CD8+的单阳性细胞，随血液循环进入外周淋巴器官中定居。阴性选择过程中，胸腺皮质和髓质交界处的巨噬细胞和树突细胞表达高水平的的MHC I、II类抗原，后者与自身抗原形成复合物〖3-4〗。经过阳性选择的胸腺细胞识别此抗原复合物，将此视为自身抗原，并引起针对这类抗原的T细胞克隆消除，并由此产生免疫耐受。
本实验结果表明，注入2.5×107的脾细胞联合细辛脂素，在术前7日可以诱导出大鼠心脏移植的免疫耐受，并且经混合淋巴细胞培养证实，免疫耐受具有供体特异性，但在术前7日预处理组较术前3日预处理组移植物生存时间长、外周血细胞因子IL-4、IL-10升高明显，两者 之间具有极显著性差异。（P<0.01）而术前1日预处理组也对移植物生存时间和细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10产生一定的影响，但效果与术前7日预处理组有显著性差异。此外，单纯应用细辛脂素具有一定的免疫抑制作用，经过体外混合淋巴细胞培养证实，产生免疫抑制作用也与在定程度上诱导了免疫耐受有关。但效果也明显弱于联合免疫耐受诱导组。
本研究进一步证实胸腺在同种异体心脏移植免疫耐受产生是一个免疫特惠器官；特别是前T淋巴细胞在分化和成熟过程中，在胸腺微环境内接触到同种异基因抗原，就可能驯化出对异体MHC抗原耐受的T细胞。细辛脂素起到了一定的免疫抑制作用，从而成功诱导出心脏移植的免疫耐受。同时也说明，经胸腺注射2.5×107供体脾细胞来诱导大鼠心脏移植免疫耐受是可行的。本研究为临床器官移植病人实行免疫耐受诱导提供了基础。
参考文献
[1] 杨云等.中药化学成分提取分离手册.中国中医药出版社，1998，189－192
[2] 张丽丽，等.中华心血管病杂志，2003，31（6）：444-447
[3] Miller JF, et al. Adv Immunol, 1962, 2: 111-116
[4] Adkins B, et al. Annu Rev Immunol, 1987, 5: 325-329
转载注明来源:https://www.xzbu.com/2/view-5063.htm
