华木莲叶片愈伤组织诱导研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要：以华木莲叶为材料，研究消毒时间、激素浓度配比对华木莲叶片和叶柄诱导愈伤组织的影响。结果表明：华木莲叶片和叶柄用浓度为0.1%HgCl2消毒，消毒时间分别为8、5 min，存活率最高，分别为32.15%、49.06%。华木莲叶片诱导愈伤组织适宜激素浓度配比为1.5 mg/L6-BA+0.15 mg/LIBA，叶柄诱导愈伤组织适宜激素浓度配比为2.0 mg/L 6-BA + 0.15～0.20 mg/L IBA，华木莲愈伤组织继代培养适宜培养基为MS + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA。
　　关键词：华木莲;叶片;激素;愈伤组织
　　中图分类号：S725.7文献标识码：A文章编号：1004-3020（2019）01-0011-05
　　Study on Callus Induction from Leaf Explants of Sinomanglietia glaucaYou RunCao LuyaoLiao WenxuanWang LinglingWang Wenxiu
　　Zhong LipingZheng LiliXing MengxueXiao Zufei
　　（School of Hydraulic and Ecological Engineering， Nanchang institute technologyJiangxi330099）
　　Abstract： The young leaves and petioles of Sinomanglietia glauca were used as the explants in the study. The experiment studied disinfection time and hormone concentration ratio to young leaves and petioles callus induction of Sinomanglietia glauca. The results showed that the best way to disinfect leaves and petioles of Sinomanglietia glauca were using 0.1% HgCl2 for 8min and 5min， with high survival rate and up to 32.15 % and 49.06 % respectively. The best hormone concentration ratio for leaves of Sinomanglietia glauca was 1.5 mg/L6-BA + 0.15 mg/LIBA. The best hormone concentration ratio for petioles of Sinomanglietia glauca was 2.0 mg/L6-BA + 0.15～0.20 mg/LIBA. The suitable medium for the subculture of Sinomanglietia glauca callus was MS +2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA.
　　Key words：Sinomanglietia glauca;leaf; hormone;callus
　　華木莲（Sinomanglietia glauca）木兰科落叶乔木，树干通直，树形优美，花香沁人心肺近乎幽兰，花色淡黄典雅宛若睡莲，金秋硕果累累，分布于江西和湖南个别地方，是中国特有珍稀濒危树种，也是优良的园林绿化树[1]。目前，围绕华木莲开展的研究有分类学[2-5]、形态解剖学[6-8]、生态学特性[9-10]、分子生物学[11-13]等，取得了一定的成果。本文以华木莲叶为材料，研究消毒时间、激素浓度配比对华木莲叶片和叶柄诱导愈伤组织的影响，为濒危物种华木莲的无性繁殖研究提供借鉴。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　供试材料来自南昌工程学院木兰园的华木莲。2015年6月份选取生长健壮的华木莲植株，剪取带叶柄的嫩叶，用自来水冲洗30 min，将叶片主脉去除，修剪成带2.5 cm见方，叶柄修剪成2～3 cm，待用。
　　1.2试验方法
　　1.2.1华木莲叶片组织培养
　　（1）消毒时间对华木莲叶片初代培养的影响。将修剪好的材料放入无菌罐头瓶，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞（HgCl2）进行消毒，消毒时间分别为3、4、5、6、8、10 min，用无菌水冲洗3～5次，叶片放在无菌滤纸上吸干表面水分，再修剪成0.5 cm见方的小块，接种在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L培养基。每个处理20瓶，每瓶5～8个叶盘。
　　（2）激素浓度配比对华木莲叶片诱导愈伤组织的影响。将修剪好的材料放入无菌罐头瓶，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞进行消毒，消毒时间为8 min，用无菌水冲洗3～5次，叶片放在无菌滤纸上吸干表面水分，再修剪成0.5 cm见方的小块，接种在MS培养基，添加6-BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L），IBA（0.05、0.15、0.45、0.60 mg/L）。每个处理20瓶，每瓶5～8个叶盘。
　　1.2.2华木莲叶柄组织培养
　　（1）消毒时间对华木莲叶柄初代培养的影响。将修剪好的叶柄放入无菌罐头瓶，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞进行消毒，消毒时间分别为3、5、7、9 min，用无菌水冲洗3-5次，叶片放在无菌滤纸上吸干表面水分，将叶柄两端剪除1～2 mm，立刻接种在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L培养基。每个处理20瓶，每瓶2～3个叶柄。 　　湖北林业科技第48卷第1期尤润，等：华木莲叶片愈伤组织诱导研究（2）激素浓度配比对华木莲叶柄诱导愈伤组织的影响。将修剪好的叶柄放入无菌罐头瓶，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞进行消毒，消毒时间分别为5 min，用无菌水冲洗3～5次，叶片放在无菌滤纸上吸干表面水分，将叶柄两端剪除1～2 mm，接种在MS培养基，添加6-BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L），IBA（0.05、0.15、0.20、0.50 mg/L）。每个处理20瓶，每瓶2～3个叶柄。
　　1.3数据统计与分析
　　采用Excel2010软件进行数据的录入、整理和方差分析。主要调查指标如下：
　　存活率（%）=（存活的外植体数/接种的外植体数）×100
　　污染率（%）=（污染的外植体数/接种的外植体数）×100
　　褐化率（%）=（褐化的外植体数/接种的外植体数）×100
　　愈伤率（%）=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）×100
　　2结果与分析
　　2.1华木莲叶片组织培养
　　2.1.1消毒时间对华木莲叶片初代组织培养的
　　影响由表1可知，华木莲茎段消毒3 min，污染率100%，显著高于其它消毒时间，消毒4 min，污染率降低到85.33%，消毒5 min，污染率降低到58.67%，消毒6 min，污染率降低到42.15%，消毒8 min和10 min，污染率较低，分别为26.33%和24.13%，之间差异不显著。消毒3 min和4 min，褐化率较低，分别为25.17%和23.67%，之间差异不显著;消毒5 min、6 min和8 min，褐化率显著提高，褐化率35%左右;消毒10 min，褐化率最高，為65.83%。存活率呈现先升后降的变化趋势，消毒8 min，存活率最高，为32.15%，之后存活率显著下降。因此，随着消毒时间的增加，华木莲叶片组织培养污染率逐渐降低，而褐化率逐渐升高，存活率先升后降。综合污染率、褐化率和存活率3个指标，华木莲叶片组织培养消毒最佳时间为8 min。
　　2.1.2激素浓度配比对华木莲叶片诱导愈伤组织的影响
　　由表2可知，在IBA浓度不变的情况下，随着6-BA浓度的增加，华木莲叶片的诱导愈伤率呈现逐渐升高的趋势。6-BA浓度为1.5 mg/L和2.0 mg/L，愈伤组织诱导率最高，分别为38.17%和35.83%，之间差异不显著，显著高于处理1和处理2，叶盘四周形成大量愈伤组织，诱导出愈伤组织时间短，愈伤组织生长快，颜色为白色，疏松、质量好（图1），而处理1和处理2，叶盘四周形成愈伤组织较少，愈伤组织增殖较慢，颜色为黄色、密实、坚硬，有的部分褐化、发黑。6-BA浓度不变，华木莲叶片诱导愈伤率随着IBA浓度的增加呈现先升后降趋势。IBA浓度0.15 mg/L诱导愈伤率最高，为38.17%，显著高于其它处理，愈伤组织质量最好。因此，华木莲叶片诱导愈伤组织形成适宜激素配比为1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA。
　　2.2华木莲叶柄组织培养
　　2.2.1消毒时间对华木莲叶柄初代培养的影响
　　由表3可知，华木莲叶柄消毒3 min，污染率46.94%，显著高于其它消毒时间，消毒5 min和7 min污染率显著降低，消毒9 min，污染率最低，降低到13.33%。褐化率随着消毒时间的增加，显著升高。存活率呈现先升后降的变化趋势。综合污染率、褐化率和存活率3个指标，华木莲叶柄组织培养消毒最佳时间为5 min，相对于叶片，叶柄较容易消毒，污染率和褐化率低，存活率高。
　　2.2.2激素浓度配比对华木莲叶柄诱导愈伤组织的影响
　　由表4可知，在IBA浓度不变的情况下，随着6-BA浓度的增加，华木莲叶柄诱导愈伤率呈现逐渐升高的趋势。6-BA浓度为2.0 mg/L时，愈伤组织诱导率最高，为35.33%，切口有较多愈伤组织形成，愈伤组织生长快，乳白色、疏松，愈伤组织质量好（图2）。6-BA浓度不变，华木莲叶柄诱导愈伤率随着IBA浓度的增加呈现先升后降趋势。IBA浓度0.2 mg/L诱导愈伤率最高，为33.83%，切口有较多愈伤组织形成，愈伤组织生长快，白色、疏松，愈伤组织质量最好，与0.15mg/L处理差异不显著。因此，华木莲叶柄诱导愈伤组织形成最适激素配比为MS+2.0mg/L 6-BA+0.15～0.2 mg/L IBA。
　　2.3华木莲愈伤组织继代培养
　　华木莲愈伤组织继代培养（图1、图2），采用MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA培养基，愈伤组织增殖速度快，15 d左右基本能够盖满整个培养基，需及时继代，否则愈伤组织老化、发黑，最总死亡。
　　3讨论与结论
　　叶是植物组织培养常用外植体，影响叶片组织培养的因素较多，如基因型[14]、叶龄[15]、消毒时间[16]、激素[17]等。外植体消毒时间长短，影响外植体污染率和褐化率，直接影响外植体的成活率。有研究表明，桂花嫩叶组织培养使用0.1%HgCl2溶液消毒5 min，消毒效果较好，无菌存活率达到66.70%[18]。中华枸杞嫩叶采用0.1%HgCl2溶液消毒8 min效果最好，污染率和死亡率低[19]。本研究结果表明，华木莲叶片采用0.1%HgCl2溶液消毒8 min，叶柄消毒5 min，效果最好，存活率最高，分别为32.15%、49.16%。
　　外源激素是植物叶片组织培养成功的关键因子。不同激素对植物叶片诱导愈伤组织的影响不同，同一激素不同浓度对植物叶片诱导愈伤组织的影响也不同。侯思宇[20]等研究BA、TDZ和IBA对樱桃叶片离体再生过程中出愈率、出芽率的影响。结果表明，2.0 mg/LBA对樱桃叶片出愈率、出芽率有显著影响，TDZ和IBA对樱桃叶片再生体系建立影响不大。汤飞云[21]等研究结果表明，2，4-D对黑莓叶片愈伤组织的诱导和愈伤组织的 　　生长状态效果较好，培养基中添加1.0 mg/L 2，4-D诱导的愈伤组织多，质地疏松，愈伤组织为嫩黄色。本研究结果表明，华木莲叶片诱导愈伤组织适宜激素浓度配比为1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA，愈伤率38.17%，叶柄诱导愈伤组织适宜激素浓度配比为2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA，愈伤率35.33%，华木莲愈伤组织继代培养适宜培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L IBA。
　　参考文献
　　[1]俞志雄.华木莲属：木兰科一新属[J].江西农业大学学报，1994，16（2）：202-204.
　　[2]郑庆衍.木莲属一个种的新称[J].植物分类学报，1995，33（2）：356.
　　[3]郑庆衍.华木莲学名的订正[J].南京林业大学学报，1995，19（1）：46.
　　[4]林新春，俞志雄.江西木兰科植物的初步整理[J].植物研究，2004，24（1）：5-9.
　　[5]林新春，俞志雄.江西木兰科植物修订[J].植物研究，2004，24（3）：272-273.
　　[6]俞志雄，肖德興，廖军，等.3种木兰科植物聚合果轴的比较解剖[J].江西农业大学学报，1999，21（1）：87-90.
　　[7]林新春，俞志雄.9种木兰科植物的花粉形态观察[J].浙江林学院学报，2003，20（4）：353-356.
　　[8]肖德兴，俞志雄.华木莲化药的发生发育[J].热带亚热带植物学报，2004，12（4）：309-312.
　　[9]付潘文，杨清培，于志民，等.华木莲开花性状和访花昆虫的协同关系[J].东北林业大学学报，2017，45（3）：74-76.
　　[10]俞志雄，廖军，林新春，等.华木莲植物群落的生态学研究[J].江西农业大学学报，1999，21（2）：213-217.
　　[11]廖文芳，夏念和，邓云飞，等.华木莲的遗传多样性研究[J].云南植物研究，2004，26（1）：58-64.
　　[12]熊敏，王静，张志荣，等.濒危植物华木莲核基因组微卫星引物开发研究[J].植物分类与资源学报，2011，33（5）：535-539.
　　[13]林新春，俞志雄，裘利洪，等.濒危植物华木莲的遗传多样性研究[J].江西农业大学学报，2003，25（6）：805-810.
　　[14]申静静，廖玉才，李和平.甘蓝型油菜叶片组织培养体系的优化[J].湖北农业科学，2014，53（2）：447-449.
　　[15]林超，马新业，刘峰，等.白木香叶片外植体愈伤组织诱导研究[J].北方园艺，2013，（8）：97-100.
　　[16]崔美，焦其庆，陈学森，等.苹果叶片愈伤组织的诱导培养[J].山东农业科学，2012，44（3）：17-20.
　　[17]周思宇，王永清.枇杷叶片胚性愈伤组织诱导与内源激素含量的关系[J].植物科学学报，2017，35（1）：99-106.
　　[18]胡甜甜，王亚莉，杨秀莲，等.桂花花梗与叶片的愈伤组织诱导研究[J].北方园艺，2015，（19）：95-101.
　　[19]侯典云，胥华伟，李雪林，等.中华枸杞叶片离体再生技术初探[J].湖北农业科学，2014，53（12）：2928-2931.
　　[20]侯思宇，孙朝霞，王玉国.外源激素配比对樱桃叶片再生体系的影响[J].山西农业大学学报，2011，31（2）：104-108.
　　[21]汤飞云，方亮，王小敏，等.激素对黑莓‘Kiowa’叶片愈伤组织诱导的影响[J].山东农业科学，2013，45（4）：51-54.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-14838553.htm