乙型肝炎病毒基因分型技术的研究综述
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【摘 要】 目前国内外对乙型肝炎病毒的不断研究发现，乙型肝炎病毒基因型分布存在地理差异与肝病的发生、发展以及抗病毒药物的疗效都有一定的相关性。本文针对乙型肝炎病毒（HBV）生物学特征和流行病学特点对当前各种HBV基因型分型技术方法的优缺点等相关研究进行综述。
【关键词】 乙型肝炎病毒；基因分型技术；综述
【中图分类号】
R446.61 【文献标志码】
A 【文章编号】1005-0019（2019）07-285-01
乙型病毒性肝炎是感染了乙型肝炎病毒（HBV）后引发的一种疾病。其中HBV病毒作为一种嗜肝病毒，对于人体的肝细胞会造成比较大的损害，引发肝细胞炎症、坏死跟纤维化，并会直接危及到患者的生命健康安全。乙型病毒性肝炎作为全球范围内的一种传染病疾病，目前已经有超过20亿人感染过HBV，每年也越有60万人因为慢性或者急性乙型肝炎而死亡，我国是乙肝病毒感染大国，每年新发病人约有900万人。近年来，随着分子生物技术迅猛发展，人们对HBV认识的不断深入，通过对HBV基因分型，有利于更加深入细致地对HBV感染的流行病学、病因学及临床诊治研究。
1 乙型肝炎病毒生物学特征
据研究，HBV属嗜肝DNA 病毒科，其核酸为部分双链闭合环状DNA。由一条较长且长度固定的负链和一条短的长度不定的正链组成，是目前己知感染人类最小的DNA病毒。长链称为负链，它携带有病毒全部的编码信息；短链称为正链，大约是负链的50%-100%.大约有3182-3221个核苷酸组成病毒基因组。其中HBV DNA负链划分为4个开放读码框（ORF），即⑴S-ORF是乙肝表面抗原（S）所在部位，由S、Pre-S1和Pre-S2 3个区域组成，编码大、中、小3种胞膜蛋白；⑵C-ORF分为pre-C和C区是病毒感染性的决定部位，编码HBeAg和HbcAg曲段具备有高免疫原性，也是免疫攻击靶标的位置；⑶P-ORF 是最长的阅读框和S-ORF、C-ORF、X-ORF重叠，是P蛋白（即HBV-DNA多聚酶）病毒复制的主要功能单位；⑷X-ORF编码HBx蛋白作为一种多功能反式调节因素，还有着增强子跟启动子两者的转录功能，与HBV感染导致的肝细胞癌变密切相关。
2 HBV基因型的分子流行病学
HBV基因型有著一定的地理区域性特点，在不同区域中的流行以及传播方式也有着比较大的差异。因此在进行HBV自然感染史发生跟变异特点的研究过程中，也就可以通过不同地区优势基因型来进行，对于南亚及琉球群岛等地区的BBV主要基因型分布情况进行分析，结果见表1。
3 HBV基因型对抗病毒药物使用的影响
抗病毒治疗的成效既于感染者自身免疫情况有关，也于病毒基因型有关。HBV的各基因区及多数调控序列中都可发生变异，HBV基因突变会产生病毒耐药。临床上经常有因为不同区域的HBV变异所导致的免疫逃逸性跟致病性等问题出现，对于乙肝患者的诊断、治疗跟防治工作也造成了比较大的阻碍。现阶段多是采用干扰素跟核苷酸类似物来进行慢性乙型肝炎的治疗，临床应用的主要有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定。拉米夫定耐药机制为HBV-DNA聚合酶基因突变引起病毒DNA与药物结合力减弱突变部位有：rtM204I，rtM180M+rtM204V，rtL180M+rtM204I，rtV173L+rtL180M+rtM204V，其中最常见变异是rtM204V/I。阿德福韦是开链核苷酸类似物其耐药位点是HBV聚合酶P区的rtA181T/V和rtN236T，其中rtN236T的变异较常见。恩替卡韦的变异位点在HBV聚合酶P区的rtT184G，rtS202I或rtM250V，其耐药的机制可能是限制了恩替卡韦与HBV多聚酶的结合。替比夫定是较新上市的核苷类抗病毒药物，属于左旋核苷类似物，具有较拉米夫定更强的抑制HBV的活性，且耐药发生率低，治疗1年时仅5%出现变异。对于部分长期服用核苷酸类药物的患者，还要做好基因型跟耐药突变位置的检测工作，来对不同基因型乙肝患者的耐药基因进行分析，并在此基础上进行抗病毒药物的针对性选择。
4 HBV基因型分型技术的研究和发展
4.1 HBV全基因测序分型法 通过PCR扩增HBV全基因DNA的方式，可以实现HBV的全基因测序，对于不同病毒株亲缘关系以及型别的确定也有着积极意义。利用以网络为基础的HBV基因分型处理工具，只需要输入待分析序列就能够查询到结果，并且有着操作简单、信息量跟可靠性高的应用优势。但是该测序方法的成本比较多，耗费时间长而且敏感度有限，不宜进行大量标本的流行病学研究。
4.2 PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）基因分型法 PCR-RFLP技术主要是PCR跟RFLP两种技术的结合，在该测序技术中能够使用来源于RCP扩增目的片段在合适的限制性内切酶水解作用中，采用琼脂糖凝胶电泳来进行处理，让其在不同基因型片段中呈现出不同的条带加以区分，该分型方法比较简便有效，还不需要对酶切产物进行杂交跟测序处理，因此在流行病调查研究工作中获得了良好的应用效果。但是该分型方式只能够对限制酶序列内的图片进行识别，若限制酶的消化待测序列不切地或者遇到混合基因型的复杂条带时，也就难以获得良好的分型识别效果，此外还存在有参考序列过少以及图谱复杂程度高的特征。
4.3 线性探针反向杂交基因分型法 此法是比利时Innogenetics公司发明，首先需要结合待测序列来进行特异性线性探针的设计，随后将其固化在支持物上面进行PCR扩增处理，随后将扩增产物跟固相探针进行反向杂交处理，显色处理后就能够获得分型结果。此法可检测单型感染也可检测多型混合感染，是一种可信、便利、快速的方法。缺点是只能对已建立的基因型进行分型。
4.4 酶免疫测定基因型分型法（ELISA） 用辣根氧化物酶标记对乙肝病毒前S2区（b、k、m、s、u、f、g）进行特异性单克隆抗体的设计。应用双抗夹心法来进行检测时，可以通过跟待测标本进行表位组合的模式来进行基因型的鉴定工作。该分型法操作简便，能够在大样本检测中获得良好的检测效果。但是缺点是必须是HBV表面抗原阳性血清，对于混合型感染跟HBV表面抗原低水平表达的标本也难以进行有效鉴别。此外构建抗前S2基因特异性表位的单克隆抗体还有着一定的难度，而且b、k、m、s和u表位有相应基因型进行充分的表达，但是f跟g表位在一些基因型上面还有着表达不充分的问题，因此在诊断过程中存在有一定的漏检情况。 4.5 多重特異性引物PCR基因分型法 对HBV中的各型全序列以及目标序列，随后找出每种基因型相对于其它各型的独特序列，在此基础上进行针对各基因型独特引物的合理设计。通过HBV基因型特异物对待测标本进行PCR扩增处理，采用琼脂糖凝胶电泳进行标本鉴别处理。作为一种简单、快速以及高特异性的分型方法，HBV基因型特异性引物PCR分型法在临床诊断以及大规模流行病学中也能够获得良好的应用效果。缺点是单核苷酸多态性（SNP）酶切点可影响方法灵敏度，且检测中有2.9%-4.5%的检测不确定性。
4.6 反向斑点杂交基因分型法 此法是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术主要是针对各等位基因的特异性特诊，在杂交基质上进行探针点的添加，随后将标本跟待测DNA样品进行杂交处理，这样才能够实现待测样本跟互补序列探针的有效结合。在对未结合的DNA进行洗涤之后，对于特异性结合靶序列中的基因分型方法有着良好的检测效果。该办法有着快速简便、敏感度高以及特异性强的应用优势，在基因分型、基因突变检测以及病原体检测等多个方面也有着良好的应用优势。缺点是可能会因基因组探针结合位点的多态性或缺失影响灵敏度。
4.7 核酸微孔芯片杂交基因分型法 是由Song等发明了一种可以检测A-G型的低密度的核酸微孔芯片。先将病毒核酸的前S区进行PCR扩增并进行标记。扩增后，加入到已固定型特异探针的硅烷化的玻片上，再与进化树及前S序列比对。用扫描设备检测相应的荧光信号的基因分型法。此法检测单型或混型感染的样本均有着不错的特异性和灵敏度。缺点是费用昂贵，因基因组探针结合位点的多态性或缺失影响灵敏度。
4.8 实时荧光定量PCR-解离曲线基因分型法 将传统PCR扩增和检测结合，在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与荧光标记探针结合在一起，检测目的核酸称为“实时”PCR，当PCR扩增结束后，通过分析PCR扩增产物变化曲线进行分型。实时荧光定量PCR-解离曲线技术能在很大程度上避免交叉污染，具备省时、高通量、高灵敏度等优点，也可检测混合型基因感染。缺点是对PCR仪器性能要求较高且具有多色荧光的干扰；需完成多个型特异的PCR反应；会因基因组引物、探针结合位点的多态性或缺失影响灵敏度。
5 HBV基因分型技术的应用与展望
目前越来越多的研究表明，HBV基因型呈现明显的域分布差异，大规模的系统流行病学分子特征普查将更有助于人们认识不同基因型间的不同致病性对疾病演变、传播方法和HBV与机体以及药物的辩证关系，对指导抗病毒治疗有着重要的意义。这依赖于简便快速的HBV基因分型方法。当前HBV基因分类方法尚不完善，HBV基因型分类存在很多复杂因素。相信随着分子生物学技术的发展，通过不断探索研究，将会把HBV基因分型技术运用到HBV临床类型检测、预后判断及治疗方法中，实现真正个体化用药。
参考文献
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