基于ROS—MAPK信号通路探讨桃叶珊瑚苷抗心肌纤维化作用

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　　[摘要] 目的 研究桃叶珊瑚苷（AU）对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖的影响及作用机制。 方法 采用胰酶消化法及差速贴壁法培养大鼠CFs，实验分为空白对照组、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干预组、低浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。用CCK8法测定细胞增殖活性，酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量，荧光酶标仪检测活性氧（ROS）水平，Western blot法检测p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达。 结果 与Ang Ⅱ干预组比较，中、高浓度AU干预组CFs增殖和p38MAPK磷酸化被明显抑制（P < 0.05）。与Ang Ⅱ干预组比较，低、中、高浓度AU干预组ROS、Ⅰ、Ⅲ 型胶原的生成明显减少（P < 0.05）。 结论 AU可通过ROS-MAPK通路途径抑制Ang Ⅱ诱导的CFs增殖和胶原生成。
　　[关键词] 桃叶珊瑚苷；心肌成纤维细胞；增殖；活性氧；p38丝裂原活化蛋白激酶
　　[中图分类号] R541.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（b）-0014-04
　　Anti myocardial fibrosis effects of aucubin based on ROS-MAPK signaling pathway
　　LUO Lifang LI Qing CAI Lijing
　　Department of Pharmacy， Jiangxi Provincial People′s Hospital， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China
　　[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of aucubin （AU） on cardiac fibroblasts （CFs） proliferation induced by angiotension Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Rat CFs were cultured by the methods of trypsin digestion and differential adhesion. They were divided into blank control group， Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） intervention group， low concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （1 μmol/L）]， medium concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （10 μmol/L）]， high concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （100 μmol/L）]. CCK8 method was used to test cell proliferation activity， collagen type Ⅰ， Ⅲ content in cell supernatant were determed by enzyme linked immunosorbent （ELISA）， fluorescence enzyme standard instrument was used to detect reactive oxygen species （ROS） level， Western blot method was used to detect p38MAPK and p-p38MAPK protein expression. Results Compared with Ang Ⅱ intervention group， CFs proliferation and p38MAPK phosphorylation were significantly inhibited in the medium and high concentration AU intervention groups （P < 0.05）. Compared with Ang Ⅱ intervention group， low， medium and high concentration of AU intervention group ROS， the production of collagen type Ⅰ， Ⅲ decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion AU can restrain by ROS-MAPK pathway Ang Ⅱ induction of CFs proliferation and collagen formation.
　　[Key words] Aucubin； Cardiac fibroblasts； Proliferation； ROS； p38MAPK
　　目前，心血管疾病已嚴重威胁我国居民健康，由其引发的死亡率已位居总死因的首位[1-2]。众多心血管疾病不断进展的共同结局是心肌纤维化，可使室性心律失常频发及血流动力学异常，最终导致死亡。抑制或逆转心肌纤维化成为治疗多种心脏疾病的最关键的一步[3-4]。桃叶珊瑚苷（aucubin，AU）属环烯醚萜苷类化合物，主要存在于忍冬科、车前科、杜仲科植物中，是一种重要的生物活性物质，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等多种药理作用[5-7]。研究[8]表明，AU及苷元能清除DPPH自由基、超氧阴离子等自由基，对PCI2细胞氧化损伤具有保护作用。最新研究[9]发现，桃叶珊瑚苷可能通过抑制活性氧（ROS）介导的MAPK通路的激活来延缓肝脏纤维化的发生发展。基于上述研究，本研究探讨AU抗心肌纤维化的作用，并探讨其作用机制与ROS-MAPK信号通路的相关性。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物 新生（2 d龄）雄性SD大鼠，体重（8.5±1.2）g，由南昌大学动物科学部提供，合格证号：SYXK（赣）2015-0001。饲养条件：新生大鼠和母鼠同放在金属饲养笼中，室温（24±1）℃，人工照明12 h/d（7：00～19：00），自由饮食及饮水，新生大鼠由母鼠喂养。
　　1.1.2 药品与试剂 桃叶珊瑚苷标准品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：20161123），血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ，美国Sigma公司，批号：A9525），DMEM高糖培养基（凯基生物有限公司，批号：20150318），CCK-8细胞增殖检测试剂盒（全式金，批号：#J20705），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号：20170413），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20170524），小鼠抗p38 MAPK（美国Santa Cruz公司，批号：B1655）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）抗体（美国Santa Cruz公司，批号：B1643），兔抗波形蛋白（Vimentin）抗体（美国Santa Cruz公司，批号：B1607），ROS检测试剂盒（碧云天生物技术公司，批号：S0033），Ⅰ型胶原检测酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海拜力生物科技公司，批号：20170303）、Ⅲ型胶原检测ELISA试剂盒（上海拜力生物科技公司，批号：20160224）。
　　1.1.3 主要仪器 迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪（北京六一仪器厂）；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；自动酶标仪（Bio Tek Synergy H1）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的获得与培养 将出生2 d的SD大鼠在75%乙醇中浸泡数秒，对其颈部以下进行消毒，开胸取出大鼠心脏，用磷酸盐缓冲液（含双抗）清洗3次，并剪碎。依次加入0.01% Ⅱ型胶原酶、0.06%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液，重复消化2次，收集悬浮液，1000 r/min，5 min离心过滤后留取沉淀物，置于37℃ CO2恒温培养箱中。采用差速贴壁法分离培养出CFs，经免疫组化染色（Vimentin阳性）鉴定证实为CFs，待CFs细胞生长融合时传代，3～4代细胞用于实验。
　　1.2.2 实验分组 实验分为空白对照组、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干预组、低浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高浓度AU干预组[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。细胞长至融合状态时，给予相应措施。
　　1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 将细胞均匀接种至96孔板内，置于温箱培养24 h后将培养基更换为1%血清的培养基饥饿12 h，各组采用相应措施干预36 h后，将培养基换为含有10 μL CCK-8的无血清培养基100 μL，置于37℃孵育2 h，使用ELISA检测仪检测A450值。
　　1.2.4 ELISA法检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量 将培养细胞用胰酶消化后计数，以1000个/孔接种至24孔培养板孔内。待细胞长至70%～80%融合时，加入含1%血清的培养基饥饿12 h后加入不同处理因素的培养基，36 h后收集上清液。按照试剂盒说明书进行检测。各组细胞的上清液分别加入包被了抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体的96孔板，温育2 h后洗涤，加入酶标抗体工作液和显色液，终止反应后使用酶标仪（波长490 nm）测定OD值，根据标准曲线，算出各组Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量。
　　1.2.5 ROS的测定 根据试剂盒说明书进行检测。将各组干预后的细胞用PBS洗涤2～3次，并加入1 mL DCFH-DA稀释液（10 μmol/L），孵育20 min，无血清DMEM培养基洗涤3次，在酶标仪下观察荧光（485 nm为激发波长，525 nm为发射波长）。ROS水平（%）=干预组荧光值/空白对照组荧光值×100%，将空白对照组设为参考值100%，其余组ROS水平与之对比即得出相对ROS水平。
　　1.2.6 Western blot法检测p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达 各组细胞加入组织裂解液，4℃，裂解30 min，10 000 r/min离心10 min，吸取上清，即可获得总蛋白。按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。蛋白变性后上样，于湿转槽内将蛋白转印至PVDF膜，经一抗（1∶1000）4℃孵育过夜后，二抗（1∶2000）溶液中室温孵育1～2 h。加入适量ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用Quantity One软件分析各条带灰度值。
　　1.3 統计学方法
　　采用SPSS 19.0对所得数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 AU对Ang Ⅱ诱导的大鼠CFs增殖的影响
　　Ang Ⅱ干预组的OD值较空白对照组明显升高（P < 0.05）；低浓度AU干预组CFs增殖活性比Ang Ⅱ干预组略低，但差异无统计学意义（P > 0.05）。中、高浓度AU干预组CFs增殖活性均明显低于Ang Ⅱ干预组（P < 0.05），且呈剂量依赖性。见图1。
　　2.2 AU对Ang Ⅱ诱导的大鼠CFs产生Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响
　　Ang Ⅱ干预组的胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ含量较空白对照组明显升高（P < 0.05）；低、中、高浓度AU干预组的胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成均被显著抑制（P < 0.05）。见表1。 　　2.3 AU对Ang Ⅱ诱导的大鼠CFs产生ROS的影响
　　与空白对照组比较，Ang Ⅱ干预组CFs的ROS水平明显升高（P < 0.05）；低、中、高濃度的AU呈浓度依赖性地抑制ROS的产生（P < 0.05）。见图2。
　　2.4 AU对p38MAPK蛋白磷酸化的影响
　　与空白对照组比较，Ang Ⅱ干预组细胞中p-p38/p38比例明显升高（P < 0.05）。与Ang Ⅱ干预组比较，低浓度AU干预组的细胞p-p38/p38比例轻微下降，但差异无统计学意义（P > 0.05），而给予中、高浓度AU干预组的细胞p-p38/p38比例相较于Ang Ⅱ干预组出现明显的降低（P < 0.05）。见图3。
　　3 讨论
　　心肌纤维化的病理表现为心肌组织结构中胶原纤维过度沉积及各型胶原比例失调且排列紊乱[10]。研究[11]发现，CFs的异常增殖及大量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积是心肌纤维化的重要原因。目前，产生ECM的CFs成为药物治疗心肌纤维化的重要靶标。本研究探讨了AU对Ang Ⅱ诱导的CFs增殖和细胞外基质表达的影响。本研究结果显示，AU能呈浓度依赖性地抑制Ang Ⅱ诱导的CFs增殖和Col Ⅰ和Col Ⅲ的分泌，提示AU可通过抑制CFs的增殖和减少ECM沉积来抑制心肌纤维化。
　　ROS是氧化系统中产生的不稳定、高活性氧分子化合物的统称，主要包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、氢过氧化物等，它可调节细胞的增殖和凋亡[12-13]。ROS己被证实为心肌纤维化形成和进展的重要因素之一。研究[14-15]表明，ROS在CFs增殖和细胞外基质沉积过程中起着重要作用。本研究结果显示，AU在抑制CFs增殖和下调Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的同时，ROS生成也显著下降，提示抑制ROS的生成是AU抑制CFs增殖和下调Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的的主要机制之一。
　　MAPK信号通路是介导刺激信号从细胞膜传递到细胞核内并作出反应的一个主要系统[16]。MAPK家族的信号通路主要有3组：外信号调节激酶（extra -cellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK，均参与了心肌纤维化的发生发展[14]。研究[17]表明ROS的产生可激活MAPK信号通路，诱导CFs增殖和ECM过度沉积，从而导致心肌纤维化的发生发展。本研究结果显示，AU在抑制ROS的生成的同时，抑制了p38-MAPK的激活，提示AU可通过抑制ROS-p38MAPK通路来抑制CFs的增殖和细胞外基质的生成。
　　众多研究[18-20]表明，中药对心肌纤维化具有良好的疗效，如：野黄芩苷、橙皮素和柚皮苷等。本研究提示，AU可通过抑制ROS-MAPK通路的激活，有效地抑制Ang Ⅱ诱导的CFs的增殖和ECM的生成，这一结论为研发以AU为基础的抗心肌纤维化药物提供了理论依据。
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　　（收稿日期：2018-09-26 本文编辑：金 虹）
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