MAPK通路介导Prx—1抑制硅沉着病小鼠肌成纤维细胞转化

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　　[摘要] 目的 探討丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在硫氧还蛋白过氧化物酶1（Prx-1）抗硅沉着病肌成纤维细胞转化过程中的作用。 方法 将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（生理盐水）、模型组[二氧化硅（SiO2）]、转染对照组（SiO2+慢病毒载体）和Prx-1转染组（SiO2+Prx-1慢病毒）。生理盐水、SiO2及慢病毒均经支气管灌注。造模后，小鼠常规饲养12周。采用免疫组化法和免疫荧光法分别检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）表达。Western blot法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原、Prx-1、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38（P-p38）、磷酸化氨基末端激酶（p-JNK）表达。 结果 模型组和转染对照组可见矽结节和肺间质纤维化，但Prx-1转染组的上述病变减轻。模型组和转染对照组Prx-1表达无区别，但Prx-1转染组较模型组Prx-1表达增高。与对照组比较，其余各组肺组织α-SMA、8-OHdG、Ⅰ型及Ⅲ型胶原、p-ERK1/2、p-P38、p-JNK表达增多；与模型组和转染对照组比较，Prx-1转染组的上述指标表达减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Prx-1具有抑制SiO2诱导的肌成纤维细胞转化和肺纤维化作用，这种作用与降低活性氧并抑制MAPK通路活化有关。
　　[关键词] 肌成纤维细胞转化；硫氧还蛋白过氧化物酶1；活性氧；丝裂原活化蛋白激酶
　　[中图分类号] R135.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0025-05
　　MAPK pathway mediates the ability of Prx-1 to inhibite myofibroblast transformation in mice with silicosis
　　LIU Yan HONG Fan WANG Peng LI Qian BAI Zhaorong SUN Ying▲
　　Department of Pathology， School of Basic Medical Science， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063210， China
　　[Abstract] Objective To investigate the role of mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway in the transformation of thioredoxin peroxidase-1 （Prx-1） against myofibroblasts of silicosis. Methods Forty male C57BL/6 mice were randomly divided into control group （saline）， model group （SiO2）， transfection control group （SiO2 + lentivirus vector） and PRX-1 transfection group （SiO2 + Prx-1 lentivirus）. Normal saline， SiO2 and lentivirus were perfused through bronchus. After modeling， mice were fed for 12 weeks. Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） respectively. Western blot was used to detect the expression of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， Prx-1， phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （p-ERK1/2）， phosphorylated-mitogen-activated protein kinase p38 （P-p38） and phosphorylated amino-terminal kinase （p-JNK）. Results Silicon nodules and pulmonary interstitial fibrosis were found in model group and transfection control group， but the lesions were alleviated in Prx-1 transfection group. There was no difference in Prx-1 expression between model group and transfection control group， but compared with model group， Prx-1 expression increased in Prx-1 transfection group. Compared with control group， the expression of α-SMA， 8-OHdG， collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ， p-ERK1/2， p-P38 and p-JNK were increased in lung tissue of the other groups. Compared with the model group and the transfection control group， the expression of the above indicators in the Prx-1 transfection group were decreased. Conclusion Prx-1 can inhibit SiO2-induced myofibroblast transformation and pulmonary fibrosis， which is related to the reduction of oxygen-active substances and the inhibition of activation of MAPK pathway. 　　[Key words] Myofibroblast transformation； Thioredoxin peroxidase 1； Reactive oxygen species； Mitogen-activated protein kinase
　　硅沉著病是由长期吸入二氧化硅（SiO2）而引起的一种肺纤维化性疾病。在纤维化过程中，肺成纤维细胞可转化为肌成纤维细胞，从而获得迁移能力及更强的合成胶原能力[1]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其介导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）传导通路在这一转化中发挥着重要的促进作用[2-3]。硫氧还蛋白过氧化物酶-1（peroxiredoxin-1，Prx-1）是一种新型过氧化物酶，前期研究发现Prx-1通过降低ROS抑制来肌成纤维细胞分化，抗硅沉着病纤维化形成[4]。然而，Prx-1如何抑制肌成纤维细胞转化，目前并不清楚。本研究利用小鼠硅沉着病模型，观察Prx-1对SiO2诱导的肺肌成纤维细胞转化及胶原合成的影响，并探讨MAKP通路的作用，为进一步明确Prx-1抗硅沉着病纤维化作用提供参考。
　　1 对象与方法
　　1.1 实验动物
　　SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，8周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2014-0004，动物合格证号11401300075648。小鼠常规饲养于华北理工大学医学实验中心洁净级动物房[SYXK（冀）2015-0038]。温度22～25℃，相对湿度40%～60%，昼夜替换12/12 h，自由进食饮水。本研究经华北理工大学动物伦理委员会批准（华北理工大学动物伦理审批号：2015050）。
　　1.2 主要试剂
　　SiO2粉尘（美国sigma公司）；Prx-1慢病毒（苏州吉玛公司）；8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）抗体、Prx-1抗体及人α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（美国Abcam公司，生产批号：307233-9、282828-11、YH160753）；Ⅰ型胶原抗体、Ⅲ型胶原抗体、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38抗体（P-p38）抗体（美国Affinity公司，生产批号：122712、15217、2111740）；磷酸化的细胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）抗体、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）抗体（美国BD公司，生产批号：4038733、155642-16）。
　　1.3 分组
　　采用摸球法将小鼠随机分为对照组、模型组、转染对照组和Prx-1转染组，每组10只。对照组小鼠经支气管灌注生理盐水200 μL，模型组小鼠以相同方式给予50 mg/mL SiO2 200 μL，转染对照组给予SiO2悬液与慢病毒载体（107 TU/只），Prx-1转染组灌注SiO2悬液与Prx-1慢病毒（107 TU/只）。模型制备后，普通饲养12周。
　　1.4 HE染色
　　造模并普通饲养12周末，麻醉小鼠，取出肺组织，左肺固定于4%多聚甲醛，常规石蜡包埋，HE染色。
　　1.5 免疫组织化学法检测α-SMA表达
　　肺组织切片水化、修复和血清封闭后，α-SMA Ⅰ抗（1∶200稀释）4℃孵育过夜，次日Ⅱ抗孵育、DAB显色和苏木精复染。结果判断：每张切片随机选取5个高倍视野，以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性细胞比例评分：<5%（0分），5%～25%（1分），>25%～50%（2分），>50%～75%（3分），>75%（4分）。染色强度评分：无着色（0分），浅棕黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）。阳性细胞比例和染色强度的乘积为α-SMA染色评分[5]。
　　1.6 免疫荧光法检测8-OHdG水平
　　肺组织切片水化、修复及封闭后，8-OHdG Ⅰ抗4℃孵育过夜；次日Ⅱ抗避光室温孵育、封片。荧光显微镜下每张切片随机选取5个高倍视野，Image-Pro Plus 6.0软件检测积分光密度值（IOD），以平均值为8-OHdG表达水平。
　　1.7 免疫印迹法检测Prx-1、p-ERK1/2、p-JNK、P-p38及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平
　　右肺组织经裂解、离心后收集上清。40 μg总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳并转膜，相应Ⅰ抗4℃孵育过夜，次日Ⅱ抗室温孵育后电化学发光（ECL）显影，Image J软件行灰度扫描。
　　1.8 统计学方法
　　采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组小鼠肺组织病理变化及α-SMA表达
　　对照组肺组织结构完整，肺泡壁薄，无明显炎症细胞渗出。模型组和转染对照组的肺组织结构紊乱，肺泡间隔增宽，可见细胞-纤维性矽结节。与模型组比较，Prx-1转染组肺泡间隔变窄，矽结节数量及面积减小。
　　α-SMA主要分布在矽结节和肺泡间隔。与对照组比较，模型组α-SMA表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。转染对照组和模型组α-SMA表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；Prx-1转染组α-SMA表达较模型组下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。
　　2.2 各组小鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达
　　与对照组比较，模型组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。转染对照组和模型组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达差异无统计学意义（P > 0.05），但Prx-1转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。 　　2.3 各组小鼠肺组织8-OHdG水平
　　8-OHdG是一种DNA过氧化产物，其形成后由细胞核转至细胞浆，但由于其不能通过细胞膜或被降解，可稳定地存在于细胞浆，故可准确地反映ROS水平[6]。本研究中8-OHdG呈绿色荧光，对照组8-OhdG表达极少，模型组表达增多，主要位于矽结节和肺泡间隔；两组8-OhdG表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，转染对照组8-OhdG表达差异无统计学意义（P > 0.05），但Prx-1转染组8-OhdG表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3、表1。
　　2.4 各组小鼠肺组织Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK的表达
　　各组ERK1/2、p38和JNK表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，模型组Prx-1、p-ERK1/2、P-p38及p-JNK表达增多（均P < 0.05）。转染对照组与模型组的上述指标表达差异无统计学意义（P > 0.05），但与模型组比较，Prx-1转染组Prx-1水平增高，p-ERK1/2、P-p38及p-JNK水平下降，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图4、表1。
　　3 讨论
　　硅沉着病的主要病理特点是矽结节形成和肺间质纤维化，肌成纤维细胞在硅沉着病形成中发挥重要促进作用[7]。肌成纤维细胞是一种含有肌动蛋白和肌球蛋白等蛋白质的成纤维样细胞，因其分泌胶原能力强，被认为是促进器官纤维化形成过程中最重要和最主要的细胞之一[1，8]。成纤维细胞数量在正常肺组织中肌很少，TGF-β1等细胞因子可诱导肺成纤维细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞等细胞转化为肌成纤维细胞，ROS介导的MAPK通路活化参与这一转化过程[9-10]。Lai等[11]报道TGF-β1通过ROS/P38和ROS/JNK通路激活Notch3，导致成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。Wu等[12]报道荜茇酰胺（一种中药提取的单体物质）可有效降低血管紧张素Ⅱ诱导心脏成纤维细胞ROS增多，并通过抑制ROS/ERK1/2通路抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，最终抑制胶原合成，提示ROS/ERK1/2通路在心脏肌成纤维细胞转化中具有促进作用。
　　SiO2粉尘本身及SiO2激活的肺泡巨噬細胞均可产生ROS[13-14]。本研究中，与对照组比较，模型组小鼠肺泡间隔增宽，可见矽结节形成，Ⅰ/Ⅲ型胶原和8-OHdG表达水平升高，提示硅沉着病形成过程中ROS生成增多。成纤维细胞转化为肌成纤维化细胞的重要标志是α-SMA在成纤维细胞中表达很低，但在肌成纤维化细胞中高表达[1]。本研究中模型组α-SMA表达明显高于对照组，且主要存在于矽结节和肺泡间隔内，同时伴随ERK1/2、JNK及p38通路的激活，提示SiO2诱导ROS生成后，ROS/MAPK通路及肌成纤维化细胞转化间可能有密切联系。
　　Prx-1是一种新型抗过氧化物酶，可有效降低ROS水平，并抑制ROS介导的细胞内信号传导通路的活化[15-17]。既往报道[4，18-20]指出，Prx-1具有抗硅沉着病纤维化作用。本研究中，Prx-1转染组Prx-1表达较模型组明显增高，提示Prx-1慢病毒转染后的肺组织Prx-1高表达。与模型组比较，Prx-1转染组α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原表达降低，同时8-OHdG、p-ERK1/2、P-p38和p-JNK水平也明显降低，说明Prx-1通过降低ROS抑制MAPK通路活化，从而抑制肌成纤维细胞的转化和胶原合成。
　　综上所述，Prx-1具有抑制SiO2诱导的肌成纤维细胞转化和肺纤维化形成，这种抑制作用与降低ROS并抑制MAPK通路活化有关。
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　　（收稿日期：2018-11-05 本文编辑：王 蕾）
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