术前大黄素联合顺铂化疗对人食管鳞癌WIG—1mRNA的影响及其机制的研究

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　　[摘要]目的 探討术前大黄素联合顺铂化疗对人食管鳞癌野生型p53诱导基因1（WIG-1）mRNA的影响及机制。方法 选择2017年3月～2018年10月我院收治的40例食管鳞癌患者作为研究对象，所有患者均经术前病理组织检查确诊。患者确诊后均给予大黄素联合顺铂进行术前化疗，连续治疗3个疗程后对患者行手术治疗，根据术中所取组织部位的不同，分为观察组和对照组，每组各20例。观察组术中取病灶组织，对照组术中取癌旁组织（距离肿瘤部位≥3 cm）。运用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定两组患者组织中的WIG-1mRNA表达水平和观察组手术前后WIG-1mRNA的表达水平。结果 观察组患者组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.68±0.11，高于对照组的0.04±0.01，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组患者手术后食管鳞癌组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.25±0.05，低于手术前的0.68±0.11，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 WIG-1mRNA在正常组织中表达水平较低，且术前大黄素联合顺铂化疗用于食管鳞癌患者中有助于降低WIG-1mRNA的表达水平，有助于改善患者的预后，能为食管鳞癌的治疗提供分子学依据。
　　[关键词]大黄素；顺铂化疗；食管鳞癌；野生型p53诱导基因1mRNA表达；免疫组织化学法；反转录-聚合酶链反应技术
　　[中图分类号] R571 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）4（b）-0067-04
　　[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of preoperative Emodin combined with Cisplatin on the expression of wild-type p53-induced gene 1 （WIG-1） in human esophageal squamous cell carcinoma. Methods Forty patients with esophageal squamous cell carcinoma admitted to our hospital from March 2017 to October 2018 were selected as subjects， all patients were diagnosed by preoperative pathological examination. Patients were given Emodin combined with Cisplatin for preoperative chemotherapy after diagnosis. After three consecutive courses of treatment， patients were operated on， according to the different tissues taken during the operation， patients were divided into observation group and control group， with 20 cases in each group. In the observation group， the lesion tissue was taken during the operation， while in the control group， the adjacent tissue was taken during the operation （distance from the tumor site （≥3 cm）. The expression of WIG-1 in tissues of the two groups and the expression of WIG-1 before and after operation in the observation group were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The expression level of WIG-1 in the observation group was 0.68±0.11， higher than 0.04±0.01 in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of WIG-1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues after operation in the observation group was 0.25±0.05， lower than 0.68±0.11 before operation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The expression level of WIG-1 in normal tissues is low. Preoperative Emodin combined with Cisplatin chemotherapy is helpful to reduce the expression level of WIG-1 in esophageal squamous cell carcinoma patients， improve the prognosis of patients， and provide molecular basis for the treatment of esophageal squamous cell carcinoma. 　　[Key words] Emodin； Cisplatin chemotherapy； Esophageal squamous cell carcinoma； Wild-type p53-induced gene 1 mRNA expression； Immunohistochemistry； Reverse transcription-polymerase chain reaction technique
　　食管癌是一种起源于食管鳞状上皮和柱状上皮的恶性肿瘤，临床上将其分为食管鳞癌与腺癌两种，鳞癌占食管癌的90.0%[1]。食管鳞癌发病早期临床症状缺乏典型性，多数患者确诊时已是中晚期，丧失了最佳根治时期。为了提高治愈率及生存率，食管鳞癌患者更多的以手术切除辅助化疗、放疗及免疫治疗等综合治疗为主[2-3]。临床研究显示，术前化疗在延长食管癌患者的生存时间中，具有不可替代的作用[4]。顺铂是常用的广谱化疗药物，能抑制肿瘤细胞的生长。顺铂主要诱导两种细胞凋亡反应通路，一方面依赖p53，另一方面则依赖p73促进肿瘤细胞凋亡[5-6]。p53基因是目前发现的与人的肿瘤高度相关的基因，可以分为突变型p53与野生型p53两种基因，前者参与了肿瘤细胞的产生并被后续的研究证明是一种肿瘤促进因子，野生型p53基因则是一种抑癌因子[7]。野生型p53诱导基因1（wild-type p53-induced gene 1，WIG-1）是鼠类PAG608基因的人类同源体，能利用其特有的锌指结构与特定的蛋白、RNA及DNA等相结合，产生抑制细胞生长的作用[8]。本研究采用随机对照的方法，探讨术前大黄素联合顺铂化疗对人食管鳞癌WIG-1mRNA的影响及机制，现报道如下。
　　1资料与方法
　　1.1一般资料
　　选择2017年3月～2018年10月我院收治的40例食管鳞癌患者作为研究对象，所有患者均经术前病理组织检查确诊。患者确诊后均给予大黄素联合顺铂进行术前化疗，连续治疗3个疗程后对患者行手术治疗，根据术中所取组织部位的不同，分为观察组和对照组，每组各20例。观察组术中取病灶组织，对照组术中取癌旁组织（距离肿瘤部位≥3 cm）。
　　患者中，男25例，女15例；年龄48～83岁，平均（58.95±7.81）岁；肿瘤直径1～8 cm，平均（4.23±0.77）cm。肿瘤部位：上段15例，中段20例，下段5例。临床分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期21例，Ⅳ期10例。本研究已经医院医学伦理委员会审核批准，患者及家属均签署知情同意书。
　　纳入标准：①符合食管鳞癌临床诊断标准，均经手术病理检查确诊者；②符合手术治疗适应证，术前均能耐受大黄素联合顺铂化疗者；③能遵医嘱完成相关检查、治疗者。排除标准：①合并严重心、肝、肾等基础疾病者；②合并精神异常或术前肿瘤发生转移者。
　　1.2仪器与试剂
　　1.2.1仪器 超净工作台、CO2孵箱、低温离心机、反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）仪、电泳仪、台式高速低温离心机、精密电子分析天平、平板电泳槽、电转仪、紫外光分光光度计、电子pH测量仪、冷藏冰箱、超低温冰柜、普通光学显微镜、电热恒温水浴锅。
　　1.2.2试剂 Trizol分离试剂、免疫组化试剂盒（SP/9002）、DAB显色试剂盒、苏木素、Sangonone-step RT-PCR kit、RNA prep-DP401 total RNA minipreps super kit、TaqDNA聚合酶、牛血清白蛋白（BSA）、二硫苏糖醇（DTT）、NC膜、十二烷基磺酸钠、噻唑蓝、二乙基焦碳酸、琼脂糖、溴化乙锭。
　　1.3方法
　　所有患者均经术前病理组织检查确诊。患者确诊后均给予大黄素联合顺铂术前化疗。
　　1.3.1大黄素（Emodin，纯度>98%）溶液的配制 用二甲基亚砜（DMSO）溶解，0.22 μm针头滤器过滤除菌，使母液浓度为4 mg/ml，-20℃冰箱中保存，实验时用完全培养基稀释到终浓度为30、60 μg/ml工作液[9-10]。
　　1.3.2病灶标本采集 用无菌生理盐水溶解，使DDP原液浓度为1 mg/ml，置于-20℃冰箱中保存，实验时同样用完全培养基稀释成终浓度为5、10 μg/ml工作液，连续进行3个疗程，疗程完毕后对患者行手术治疗，术中取病灶组织及癌旁组织[11]。
　　1.3.3 WIG-1mRNA的表达 ①提取RNA并测定其浓度。取术前病灶组织与术中病灶组织，经PBS冲洗后加入500 μl Trizol吹打，使组织充分溶解，加入500 μl Trizol充分混合、均匀。将上述溶液放入体温5 min下使蛋白充分解体，加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s，常温下放置2～3 min，离心15 min，速度为12 000 r/min，获得三层液体（上层为水相、中間层与下层为有机相）。取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加入0.5 ml异丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，离心10 min，速度为12 000 r/min，可见凝胶状沉淀（即为RNA）。充分洗涤RNA，加入250 μl DEPC与750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的冲洗后离心5 min，速度为7400 r/min，取沉淀放入工作台干燥20 min。利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯（以Rnase作为空白对照），在A260下测定吸光度值。采用Dnase酶处理RNA，并完成RNA向cDNA的转换，处理完毕后放入冰箱备用。②PCR反应。检测WIG-1及其下游基因mRNA的表达水平。WIG-1的上游引物为5′-CCAACTCCCTCCTCAGACCCG-3′；下游引物为5′-CCTGGGCAAATATACAGTCC-3′。β-actin鼠抗人单克隆抗体。β-actin上游引物为5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′。β-actin下游引物为5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′；设定反应条件为30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，连续进行35个循环，最后72℃下完成10 min延长。取hGAPDH为内参，选择获得的扩增产物，放入1.5%琼脂凝胶进行电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定。β-actin为内参[12-13]。 　　1.4观察指标及评价标准
　　采用RT-PCR检测食管鳞癌组织与癌旁组织中WIG-1mRNA的表达水平及手术前后食管鳞癌组织中WIG-1mRNA的表达水平。比较两组患者组织中WIG-1mRNA的表达水平和观察组患者手术前后WIG-1mRNA的表达水平。
　　1.5统计学方法
　　采用统计学软件SPSS 18.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1两组患者组织中WIG-1mRNA表达的比较
　　观察组患者的WIG-1mRNA表达水平为0.68±0.11，高于对照组的0.04±0.01，差异有统计学意义（t=8.514，P=0.00）。
　　2.2观察组患者手术前后WIG-1mRNA表达水平的比较
　　观察组患者手术后组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.25±0.05，低于手术前的0.68±0.11，差异有统计学意义（t=8.385，P=0.000）（图1）。
　　3讨论
　　顺铂是人食管鳞癌患者中常用的化疗药物，能抑制肿瘤细胞的增殖与生长。临床研究显示，顺铂是一种广谱化疗药物，用于人食管鳞癌中能诱导两种细胞凋亡反应通路，一个是依赖p53，另一个则依赖p73促进肿瘤细胞凋亡。但随着患者化疗周期及化疗时间的延长，化疗药物耐药性呈上升趋势，易增加恶心、呕吐等毒副反应，影响患者治疗耐受性和依从性[14]。因此，积极寻找特异性高、耐药性好的联合治疗药物对改善患者预后具有重要的意义。
　　大黄素是从大黄属、番泻叶等中药中分离获得的活性成分，是一类蒽醌类药物，能清除氧自由基，发挥抗炎、抗肿瘤等功效。现代药理结果显示，大黄素能抑制胰酶活性，发挥免疫调节、抗菌、抗炎及抑制血小板等功效，有助于改善局部微循环，降低血液黏度，从而减轻缺血再灌注对组织器官的损伤作用[15]。临床研究显示，大黄素能通过多种信号通路的调节作用发挥肿瘤抑制作用，并且具有明显的抑制凋亡、抗氧化及抗增殖等作用[16]。本研究中，人食管鳞癌患者确诊后术前给予大黄素联合顺铂化疗，然后对患者进行手术治疗。本研究结果显示，观察组患者的WIG-1mRNA表达水平为0.68±0.11，高于对照组的0.04±0.01，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组患者手术后组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.25±0.05，低于手术前的0.68±0.11，差异有统计学意义（P<0.05）。提示术前大黄素联合顺铂化疗用于人食管鳞癌患者中能发挥不同的治疗优势，有助于降低WIG-1mRNA表达水平，从根本上控制疾病的发生发展，为患者后续手术治疗奠定基础。同时本研究亦存在诸多不足，一方面纳入病例数较少，尚需大样本容量验证；另一方面进行数据统计处理时存在较大的人为误差，均需要进一步研究与探讨。
　　综上所述，WIG-1mRNA在正常组织中表达水平较低，术前大黄素联合顺铂化疗用于食管鳞癌患者中有助于降低WIG-1mRNA的表达水平，改善患者的预后，能为食管鳞癌治疗提供分子学依据。
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　　（收稿日期：2018-10-22 本文编辑：刘克明）
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