芒柄花黄素对实验小鼠免疫功能的影响

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　　摘要 [目的]研究芒柄花黄素对实验小鼠免疫功能的影响。[方法] 取SPF级雄性昆明小鼠40只，随机分为低、中、高剂量芒柄花黄素试验组和对照组，连续注射芒柄花黄素4周后检测各组小鼠巨噬细胞的吞噬功能、小鼠脾细胞凋亡率及转化率、小鼠血清中溶菌酶、IgG、IFN-γ及IL-4的含量。[结果] 中、高剂量芒柄花黄素组小鼠巨噬细胞吞噬率及血清溶菌酶含量高于对照组及低剂量组，差异显著（P<0.05）。低、中、高剂量芒柄花黄素组小鼠脾细胞凋亡率低于对照组，差异显著（P<0.05）。中、高剂量组小鼠脾细胞转化率高于低剂量组及对照组，差异显著（P<0.05）。中、高剂量芒柄花黄素组小鼠血清IgG含量高于对照组及低剂量组，差异显著（P<0.05）。低、中、高剂量芒柄花黄素组小鼠血清中IL-4含量高于对照组，差异显著（P<0.05），而小鼠血清中IFN-γ含量在各组间差异不显著（P>0.05）。[结论]芒柄花黄素可以提高小鼠的固有免疫功能，抑制脾细胞凋亡并提高其转化率。
　　关键词 芒柄花黄素;脾细胞;固有免疫
　　中图分类号 S852.4文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）10-0086-03
　　Abstract [Objective] To study the effects of formononetin on the immune functions of mice. [Method] 40 male Kunming mice （SPF class） were divided into 4 groups， including low dose group， middle dose group， high dose group and control group. The phagocytic function of macrophages，the apoptosis rate and conversion rate of spleen cells，the contents of lysozyme，
　　IgG， IFNγ， IL4 in the serum of mice were detected after injecting formononetin for four weeks continuously. [Result]The phagocytosis rate of macrophage and serum lysozyme content of mice in the mediumdose group and highdose group of formononetin were higher than those  in the control group and lowdose group， and the difference was significant （P<0.05）. The apoptosis rate of mice spleen cells in the lowdose group， mediumdose group and highdose group of formononetin was lower than that in the control group， and the difference was significant （P<0.05）.The transformation rate of spleen cells in the mediumdose group and hig dose group was higher than that in the lowdose group and the control group， and the difference was significant （P<0.05）. The serum IgG content of mice in the mediumdose group and highdose group of formononetin was higher than that in the control group and the low dose group，  and the difference was significant （P<0.05）. The content of IL4 in the serum of mice in lowdose group， mediumdose group and highdose group of formononetin were higher than those of the control group， and the differences were significant （P<0.05）， while the content of IFNγ in the serum of mice were not significant among different groups （P>0.05）. [Conclusion] Formononetin can improve the innate immune function， inhibit the apoptosis of spleen cells and improve their transformation rate in mice.
　　Key words Formononetin;Spleen cell;Innate immune
　　芒柄花黃素，又名芒柄花素、刺芒柄花素，是红三叶草、鸡血藤、黄芪等多种中草药的活性成分之一[1]，芒柄花黄素因具有异黄酮结构而成为一种典型的植物雌激素[2]。目前研究表明芒柄花黄素在治疗膀胱癌[3]、胃癌[4]等恶性肿瘤方面可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。此外，芒柄花黄素可以通过减少自由基生成，增强抗氧化酶活性、调节能量代谢发挥抗疲劳作用[5]。笔者探讨了芒柄花黄素对实验小鼠免疫功能的影响，以期为芒柄花黄素的临床应用提供理论依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 试剂。芒柄花黄素购自成都瑞芬思生物技术有限公司（纯度>98%），TUNEL一步法凋亡检测试剂盒、羊抗鼠IgG抗体、IL-4和IFN-γ免疫检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。
　　1.1.2 实验动物。雄性昆明小鼠40只，SPF级，6～8周龄，体重（20.0±2.0）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号为SCXK（京）2017-0001，动物房许可证号为SYXK（冀）2015-0038，相对湿度为（60±5）%。试验期间自由饮水，采食标准饲料。
　　1.1.3 动物分组。实验小鼠适应性喂养7 d后，将小鼠按照体重编号，采用随机数字法分为4组，分别为低、中、高剂量芒柄花黄素试验组和对照组，每组10只。低、中、高剂量芒柄花黄素试验组分别按照10、20和30 mg/（kg·d）的剂量肌肉注射芒柄花黄素溶液0.5 mL，对照组小鼠肌肉注射等体积生理盐水，连续注射4 周。乙醚麻醉后心脏取血，1 500 r/min离心10 min后分离血清，备用。
　　1.2 方法
　　1.2.1 巨噬细胞吞噬功能的测定。肌肉注射4周后，于每只小鼠腹腔注射10%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后腹腔注射生理盐水1 mL，轻揉腹部，抽取腹腔液滴于洁净载玻片上。自然干燥后，10%甲醇溶液固定10 min，瑞士染色后镜检。每张玻片计数100个巨噬细胞，按以下公式计算巨噬细胞吞噬率：
　　巨噬细胞吞噬率=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞个数/100）×100%。
　　1.2.2 血清溶菌酶含量的测定。将溶壁微球菌接种于琼脂培养基上，37 ℃下培养24 h，收集菌苔，备用。将100 mL 1%磷酸盐缓冲液琼脂加热熔化，待冷至55 ℃时加入溶壁微球菌菌液1 mL（每毫升琼脂内含标准溶壁微球菌1 mg）混和均匀，注入无菌平皿，琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板打孔，孔径5 mm。取50 μL血清加入琼脂孔内，以标准溶菌酶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。将平皿置于35 ℃培养12 h，测定琼脂孔周围溶菌环直径，计算样品血清中溶菌酶活性[6]。
　　1.2.3 小鼠脾细胞凋亡的测定。乙醚麻醉小鼠后，剪开腹腔，分离脾脏，去除其周围脂肪组织及筋膜，放入盛有PBS的无菌平皿中，轻研脾脏，细胞筛过滤，使脾细胞分散成细胞悬液，将脾细胞悬液1 000 r/min离心力离心5 min，收集沉淀细胞，加入1 mL红细胞裂解液，充分混匀，室温放置1 min，加入PBS缓冲液，终止红细胞裂解。加入PBS缓冲液，1 000 r/min离心5 min，以PBS重悬沉淀细胞涂片，冰浴孵育2 min后用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤。加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤，封片后荧光显微镜观察并计数。
　　1.2.4 脾细胞转化率检测。以含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀脾细胞，转移至无菌细胞培养瓶，补充培养液至10 mL，加入1 000 μg/mL PHA 0.1 mL，置于37 ℃ 5% CO2孵箱培养72 h后涂片，自然干燥后甲醇固定3 min，吉姆萨染色后镜检。观察100个淋巴细胞，计算淋巴母细胞所占百分率，即淋巴细胞转化率[7]。
　　1.2.5 血清IgG含量的测定。将2 g琼脂粉加入100 mL蒸馏水中，加热熔化，置于56 ℃水浴箱中保温，加入羊抗鼠IgG抗体（稀释比例为1∶60），轻轻混匀后，取4 mL琼脂均匀浇注于洁净载玻片上，制成厚度约1.5 mm的羊抗鼠IgG抗体琼脂板，待琼脂凝胶完全凝固后，使用打孔器在琼脂板上打孔，直径3 mm，孔距20 mm。分别于琼脂孔中加入20 μL 1∶4稀释的待测血清及标准品，置于垫有潮湿纱布的托盘内，加盖，37 ℃温育18 h，测量沉淀环直径，计算沉淀环面积，根据標准品的沉淀环面积，绘制标准曲线，计算样品中IgG含量[8]。
　　1.2.6 血清IL-4和IFN-γ含量的测定。取待测血清标本和标准品50 μL分别加入96孔板内，各孔分别加入生物素标记的抗小鼠IL-4或IFN-γ抗体50 μL，37 ℃孵育60 min，洗板5次，甩去孔内残留液体;各孔分别加入50 μL HRP标记亲和素，37 ℃孵育30 min，洗板5次，甩去孔内残留液体;加底物工作液50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加终止液50 μL。连续波长酶标仪测定450 nm波长的吸光度值，绘制标准曲线，测定各组小鼠血清中IL-4和IFN-γ的含量。
　　1.3 数据统计与分析
　　使用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行统计与分析，各组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准取双侧α=0.05。
　　2 结果与分析
　　2.1 芒柄花黄素对小鼠巨噬细胞吞噬功能和血清溶菌酶含量的影响
　　由表1可知，中、高剂量芒柄花黄素组小鼠巨噬细胞吞噬率及血清溶菌酶含量高于对照组及低剂量组，差异显著（P<0.05）;低剂量芒柄花黄素组与对照组相比差异不显著（P>0.05），中剂量组与高剂量组相比差异不显著（P>0.05）。这说明中剂量及高剂量芒柄花黄素可以提高小鼠巨噬细胞吞噬率及血清溶菌酶含量。
　　2.2 芒柄花黄素对小鼠脾细胞凋亡及转化率的影响
　　TUNEL法检测小鼠脾细胞凋亡结果表明，低剂量、中剂量与高剂量芒柄花黄素组小鼠脾细胞凋亡率均低于对照组（P>0.05），中剂量组及高剂量组小鼠脾细胞凋亡率均低于低剂量组（P>0.05），结果见图1及表2。淋巴细胞转化试验结果表明，中、高剂量组小鼠脾细胞转化率高于低剂量组及对照组，差异显著（P<0.05）;芒柄花黄素低剂量组与对照组、中剂量组与高剂量组淋巴细胞转化率差异均不显著（P>0.05）（表2）。这表明芒柄花黄素可以抑制小鼠脾细胞凋亡并提高其转化率。 　　2.3 芒柄花黄素对小鼠血清中IgG、IL-4和IFN-γ含量的影响
　　单向琼脂扩散试验结果表明，中、高剂量芒柄花黄素组小鼠血清IgG含量高于对照组及低剂量组，差异显著（P<0.05）;低剂量芒柄花黄素组与对照组、中剂量组与高剂量组血清IgG含量差异均不显著（P>0.05）。ELISA结果显示，低、中、高剂量芒柄花黄素组小鼠血清中IL-4含量均高于对照组，差异显著（P<0.05）;中、高剂量芒柄花黄素组小鼠血清中IL-4含量均高于低剂量组，差异显著（P<0.05）;中剂量芒柄花黄素组小鼠血清中IL-4含量与高剂量组差异不显著（P>0.05）。小鼠血清中IFN-γ含量在各组间差异均不显著（P>0.05），结果见表3。研究结果提示芒柄花黄素可以提高小鼠体液免疫功能，但对细胞免疫功能无影响。
　　3 讨论
　　巨噬细胞处于机体固有免疫的第一道防线，在机体非特异性免疫应答中发挥重要作用[9]。巨噬细胞主要通过吞噬、
　　抗原提呈和分泌多种细胞因子发挥免疫应答及调节作用。在感染初期，巨噬细胞可通过直接吞噬并杀灭入侵病原体，参与抗感染免疫[10]。溶菌酶是一种具有溶解G-细菌能力的水解酶[11]，是巨噬细胞胞外杀菌作用的主要成分。溶菌酶通过水解细菌细胞壁中的肽聚糖，裂解细菌，从而清除入侵体内的病原体。因此，评价巨噬细胞吞噬功能与溶菌酶活性可反映机体固有免疫功能状态[12]。该研究结果表明，低剂量芒柄花黄素对小鼠巨噬细胞吞噬功能及溶菌酶活性无明显影响，而中、高剂量芒柄花黄素能够提高巨噬细胞吞噬功能及溶菌酶含量，提示中等剂量以上芒柄花黄素可以增强实验小鼠的固有免疫应答功能。
　　脾脏中淋巴细胞包括T细胞与B细胞，而T细胞与B细胞是人体主要的免疫细胞[13]。脾细胞数量及功能的相对稳定对于维持机体适应性免疫应答发挥重要作用。在一些诱发因素（如射线、药物等）的作用下，可引起细胞凋亡率发生改变。减少病理性凋亡的发生有利于机体免疫系统的抗感染及抗肿瘤能力。此外，淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，表現为细胞体积增大，代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，转化为淋巴母细胞。淋巴细胞转化增殖能力越高，机体内效应淋巴细胞数目越多，因此淋巴细胞转化率可反映淋巴细胞的免疫功能状态[14]。TUNEL法检测小鼠脾细胞凋亡结果表明，芒柄花黄素作用小鼠后小鼠脾细胞凋亡率降低，并且这种作用呈现剂量依赖性的特点。淋巴细胞转化试验结果表明，中、高剂量芒柄花黄素作用小鼠后小鼠脾细胞转化率增加。研究结果提示芒柄花黄素可以降低小鼠脾细胞凋亡并提高其转化率。
　　抗体是参与机体体液免疫的主要分子，其中IgG类抗体是血清中抗体的主要成分，占血清免疫球蛋白总量的75%～80%，具有抗病毒、抗菌、调理吞噬、抗毒素等作用，检测IgG类抗体含量可反映机体的体液免疫功能状态[15]。IL-4是一种重要的Th2型细胞因子，能够促进B细胞增殖、活化、分化并合成免疫球蛋白[16]，在机体体液免疫反应中发挥重要作用正向调节作用[17]。IFN-γ主要是由Th1细胞分泌的细胞因子[18]，能够干扰病毒复制，在机体细胞免疫应答中发挥重要调节作用[19]。该研究结果表明芒柄花黄素可以提高小鼠血清中IgG类抗体和IL-4含量，而芒柄花黄素对小鼠血清中IFN-γ含量无明显影响。这提示芒柄花黄素可以增强机体体液免疫应答能力，而这种调节作用可能是通过上调Th2型细胞因子IL-4的分泌，从而增加脾细胞IgG类抗体的合成而实现的，而芒柄花黄素对实验小鼠细胞免疫无影响。
　　综上所述，芒柄花黄素可以提高实验小鼠巨噬细胞的吞噬功能，促进溶菌酶的合成与分泌，增强小鼠的固有免疫功能。同时，芒柄花黄素还可以通过抑制脾细胞凋亡、增强脾细胞转化增殖能力，提高Th1型细胞因子IL-4的分泌水平，从而促进B细胞IgG类抗体的合成，提高机体的体液免疫功能。然而，芒柄花黄素对机体细胞免疫功能无明显影响。
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