荟生源两种组方对小鼠经口急性毒性实验

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　　摘要：目的  評价荟生源两种组方的安全性，评估其临床使用安全性，为功能性食品开发和临床安全用药提供实验依据。方法  将26只SPF级昆明小鼠采用随机数目表法随机分为3组，其中实验组1、实验组2各10只，空白组6只，雌雄各半。实验组1以荟生源0.96 g+生理盐水0.17 ml（按配方1最大溶解度进行配置，有效量接近于成人每日服用量200倍）灌胃、实验组2以荟生源0.4 g+生理盐水0.63 ml（按配方2最大溶解度进行配置，有效量接近于于成人每日标准服用量200倍），两组实际灌胃量均为0.8 ml;空白组以生理盐水0.8 ml灌胃，灌胃后连续观察7 d。比较3组一般情况、死亡情况、大体解剖及镜下特点。结果  3组小鼠体重、饮水量、活动度均正常，差异无统计学意义（P>0.05）;实验过程中各组均无小鼠死亡，大体解剖肉眼观察小鼠各脏器均无变性、充血、水肿、坏死等异常现象;镜下对照组小鼠肝脏、肾脏细胞形态、结构、大小均正常，无坏死、无病理性改变。实验组1小鼠肝细胞形态、结构、大小均正常，肝小叶组织结构正常;实验组2中出现1例肝细胞胞浆疏松化。各组所有动物肾组织结构肾小管结构正常，皮质与髓质分界线清楚，无淋巴细胞浸润。结论  荟生源两种组方对小鼠无急性毒性作用，具有较好的安全性。
　　关键词：荟生源;经口急性毒性实验;小鼠
　　中图分类号：R285.5                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.020
　　文章编号：1006-1959（2019）11-0072-04
　　Abstract：Objective  To evaluate the safety of Huishengyuan and its clinical safety， so as to provide experimental basis for the development of functional food and the safe use of drugs in clinic.Methods  26 SPF Kunming mice were randomly divided into three groups： experimental group 1 （n =10）， experimental group （n=10） and blank group （n=6）.Both male and female. In the experimental group 1， 0.96 g + normal saline 0.17 ml （configured according to the maximum solubility of the formula 1 and the effective amount is close to 200 times the daily dosage of the adult） was administered to the experimental group 1 and the experimental group 2 was 0.4 g+0.63 ml（of physiological saline. The maximum solubility of Formulation 2 was configured，and the effective amount was close to 200 times of the daily standard dose of adults.） The actual gastric perfusion volume was 0.8 ml; the blank group was intragastrically administered with 0.8 ml of normal saline， and was continuously observed for 7 d after gavage.Compare the general conditions， death， gross anatomy and microscopic features of the 3 groups.Results  The body weight， water consumption and activity of the three groups were normal， the difference was not statistically significant （P>0.05）. There was no mouse death in each group during the experiment.Gross dissection observed the mice without degeneration and congestion. Abnormal phenomena such as edema and necrosis; the morphology， structure and size of liver and kidney cells of the mice in the control group were normal， no necrosis and no pathological changes. The morphology， structure and size of hepatocytes in experimental group 1 were normal， and the structure of hepatic lobule was normal. In experimental group 2， 1 case of hepatocyte cytoplasmic loosening occurred. The renal tubular structure of all animals in each group was normal， the boundary between cortex and medulla was clear， and there was no lymphocytic infiltration.Conclusion  Huishengyuan two kinds of prescription have no acute toxicity to mice， and have good safety. 　　Key words：Huishengyuan;Oral acute toxicity test;Mouse
　　根據国家卫生计生委《中国癌症防治三年行动计划（2015～2017年）》统计显示，每年我国新发癌症病例约为310万。化疗是治疗肿瘤主要手段之一，对肿瘤患者的治疗有着明显效果，化疗所带来的不良反应常让患者的依从性降低，尽管患者的生存时间得到延长，但化疗相关不良反应却影响着患者的生活质量[1]，化疗所导致化疗相关性呕吐（chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV）是最常见的胃肠道反应。其发生率为65%～85%，顺铂致吐率几乎达100%[2，3]。西南医科大学护理器械研发实验室自主研制的“荟生源”产品，是依据中医“药食同源”特性，结合现代微生态研究进展而研制的产品，其根据化疗患者体质的不同，有两种不同的组方供患者使用。本实验主要通过小鼠对荟生源两种组方耐受性来验证其毒性作用，以进一步了解其生物学活性，为更好的应用于制药业和临床治疗提供依据。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物及分组  SPF级昆明种小白鼠（Kunming mice，KM小鼠）38只（预实验12只，正式急性毒性实验26只），周龄为6～8周，体重18～22 g，由西南医大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（川）2013-17]。动物分组：将26只小鼠，随机数字表法分为3组，其中实验组1和实验组2，各10只，空白组6只，均雌雄各半，编号分笼饲养。本研究通过西南医科大学动物实验伦理审查，遵照动物福利进行实验，饲养温度20～25℃，湿度40%～70%。实验中动物均单笼饲养，正常饮水进食。
　　1.2实验用药  荟生源配方1（生姜、党参、藿香等），褐色水煎剂提取液，由西南医科大学护理器械研发实验室提供;荟生源配方2（生姜、低聚甘露糖、竹茹等），白色粉末，由西南医科大学护理器械研发实验室提供。根据荟生源的两种组方，配制两种药剂，供实验组1和实验组2使用。生理盐水，四川美大康佳乐药业有限公司生产。
　　1.3实验仪器  电子秤、1 ml注射器、灌胃针、手术器械、眼科镊、刀片、乳胶手套、薄膜手套、棉签、口罩、滤纸、酒精、安尔碘、甲醛溶液、无毒小鼠笼。
　　1.4实验方法
　　1.4.1预实验  参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》[4]进行，取体重18～22 g的小鼠12只，随机分为实验组和空白组，每组6只，雌雄各半。第1次灌胃前禁食（不禁水）12 h，实验组1灌胃给药浓度为1.2 g/ml，实验组2灌胃给药浓度为1 g/ml，给药容积均为40 ml/kg，空白组灌入等量的生理盐水，给药后观察小鼠7 d内毒性反应和死亡情况。根据动物急性毒性实验观察项目（表1）记录各组动物的一般生理状况、行为活动、进食、有无中毒状和有无动物死亡，试验结束后将小鼠用颈椎脱臼致死法处死进行解剖学检查。结果未见中毒表现，亦无小鼠死亡。因1.2 g/ml浓度和1 g/ml浓度已经分别达到两种组方化学药物最大给药浓度（20 g/kg和48 g/kg），受小鼠胃容量限制，未测定出半数致死量LD50，因此需做最大给药量测定。
　　1.4.2急性毒性实验（最大给药量测定）  根据预试验测不到LD50，另取剩余KM小鼠26只，其中实验组1、实验组2各10只，空白组6只，雌雄各半。与预试验实验步骤一致，试验前禁食（不禁水） 12 h，实验组1以荟生源0.96 g+生理盐水0.17 ml（按配方1最大溶解度进行配置，给药浓度为1.2 g/ml，有效量接近于成人每日服用量200倍）灌胃、实验组2以荟生源0.4 g+生理盐水0.63 ml（按配方2最大溶解度进行配置，给药浓度为1 g/ml，有效量接近成人每日标准服用量200倍），两组实际灌胃量均为0.8 ml;空白组以生理盐水0.8 ml灌胃，三组给药容积均为40 ml/kg。灌胃次日后每日上、下午各观察1次，实验条件同前，连续观察7 d。第8天将小鼠用颈椎脱臼致死法处死，取出各组小鼠肝、肾脏，随后在生理盐水中轻轻震荡除去内容物，用10%甲醛固定液固定24 h以上，将组织包埋、切片、HE染色。
　　1.5观察指标
　　1.5.1一般情况  根据动物急性毒性实验观察项目记录动物的外观、饮食、行为、活动度[5]、体重、有否死亡等情况。
　　1.5.2肝、肾脏  ①肉眼观察有无肿胀、囊肿、萎缩、出血、水肿、颜色异常、粘连、硬化等异常改变;②镜下观察各组小鼠体重以及肝脏、肾脏病理学变化。
　　1.6统计学处理  采用SPSS 20.0，对3组小鼠体重、饮水量、进食量进行单因素方差分析，计量资料以（x±s）表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1一般情况及体重变化趋势  给药后小鼠活动减少， 1 d后活动恢复正常。试验期内无动物死亡，各给药组动物均未出现动物急性毒性实验观察项目中列举的急性中毒症状和表现，并且毛皮光滑，进食、体重增长及大小便正常，眼、鼻无异常分泌物，粘膜无充血、水肿，呼吸正常。在观察期间，实验组1、实验组2与空白组小鼠体重稳定增长，差异有统计学意义（P<0.05），3组相比较体重增长量无显著差异，差异无统计学意义（P>0.05），实验操作对小鼠体重无影响，见表2。
　　2.2小鼠肝、肾脏功能观察
　　2.2.1肉眼观察  未发现器官有肿胀、囊肿、萎缩、出血、水肿、颜色异常、粘连、硬化等异常改变，与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。
　　2.2.2 镜下观察  病理切片结果（图1）除实验组2中有1例肝脏有轻微改变外（主要表现为肝细胞胞浆疏松化较为明显，但未见肝细胞坏死及肝小叶结构的改变）（图2），其余所有小鼠肝脏组织结构、细胞形态正常，肝细胞未见明确变性、坏死改变，间质无明显充血，也未见炎性细胞浸润;所有小鼠双侧肾脏肾小球、肾小管均未见明确形态、结构的改变，未见细胞变性、坏死和脱落，肾小管内无管壁，间质无炎性细胞浸润。 　　2.3最大给药量  因受小鼠胃容量限制，此次小鼠灌胃给药最大容量为0.8 ml。配方1溶解于水内最大浓度1.2 g/ml，实际灌胃0.8 ml内含药物0.96 g，以每只小鼠标准体重20 g为准，人体标准体重60 kg为准，对人体的给药量为2.88 kg;同配方一计算方法，配方2溶解于水内最大浓度1 g/ml，实际灌胃0.8 ml内含药物0.8 g，对人体的给药量为2.4 kg。
　　3讨论
　　化疗性恶心呕吐对患者生活质量影响大，并会影响患者治疗依从性[6]，目前针对化疗性恶心呕吐在西医上多采用药物治疗，如昂丹司琼、托烷司琼、阿扎司琼、帕洛诺司琼等[7-10]，其治疗效果好，对急性呕吐具有强有效的止吐作用，但有毒副作用，易导致患者产生头晕、头痛等不良反应，对预期性恶心呕吐控制不佳，对延迟性呕吐控制不佳，单独使用有效率不高，需联合其他止吐药物[11]。中医治疗方法多样，如：①中药汤剂，如旋覆代赭汤、六君子汤、加味小半夏汤等，效果好，可增强患者免疫力，但熬制携带不便，味苦难喝，患者不易接受[12-14];②穴位治疗，可针刺获敷贴足三里穴位、大椎、中脘、曲池、内关，具有健脾和胃、降逆止吐之效，但治疗不便，会增加病人痛苦[15，16];③放松训练，有研究采用放松训练及肌肉渐进放松训练可缓解化疗患者呕吐发生率及降低其频次，在一定程度上降低其焦虑[17，18]，但此方法主观性强，效果差异大。
　　荟生源是一种安全性高、价格低廉的治疗预期性CINV的功能性食品，现阶段在进行临床有效性验证。目前传统中药制剂治疗CINV，存在剂型多样、应用时间长久、药物成分不明确等特点使用不当或者滥用，常常引起过敏反应、心脏损害等严重的不良反应。中药起效较慢，煎药时间长、量较多、味道苦，不被现代人们所接受，且许多临床医师对中药有效辩证施制掌握不好，其针对性差。荟生源功能性食品依据“药食同源”的基础理论，结合现代生物萃取技术，将组方提取制成代用茶，能有效弥补中药汤剂的不便于服用，对胃无刺激，避免了传统汤剂味道苦;又可减少因肌肉注射和静脉输液反复穿刺带来的痛苦。
　　本实验分别对两个实验组一次经口灌胃灌入荟生源配方1和荟生源配方2最大灌入量，经过7 d观察，急性毒性试验无小鼠死亡，给药各组小鼠均未出现急性中毒症状和表现，并且毛皮光滑、进食、活动度、体重增长及大小便正常;采取颈椎脱臼法处死动物解剖肉眼观查肝、肾、脾、胃、肠等主要脏器未发现形态改变;病理学检中，仅有1只动物出现干细胞轻微胞浆疏松化，引起胞浆疏松化的原因尚不明确，其原因可能为实验药物处于肝脏代谢活跃期，导致基因扩增;也可能是炎症、缺氧和毒素等，针对本实验的实际情况，仅有此1只动物异常出现在实验组2，且其胞浆疏松化的程度较为轻微，尚不能完全确定其病理学意义，病理检验提示考虑为个体差异引起，不能说明实验药物具有肝毒性，其余所有动物肝、肾功能均未见异常。本实验未测出LD50，因受小鼠胃容量限制，故得出人体对药物的最大耐受量为2.88 kg（配方1）、2.4 kg（配方2），建议人体服用配方1 的量为0.45 kg/d（试验最大给药量的6.4倍），服用配方2的量为0.4 kg/d（试验最大给药量的6倍）。
　　在后续试验中考虑更换大鼠为实验对象，进行亚急性与慢性毒性试验研究。
　　综上所述，荟生源两种组方在小鼠实验中未出现急性毒性，是相对安全的“药食同源”复方制剂。
　　参考文献：
　　[1]李光耀，刘维.化疗相关恶心呕吐的预防[J].临床药物治疗杂志，2017，15（2）：90.
　　[2]芦殿荣，芦殿香，殷玉琨，等.顺铂导致化疗相关恶心呕吐反应的中药防治[J].长春中医药大学学报，2014（4）：645-647.
　　[3]毛咏旻，王一红，谢腾，等.中西医防治顺铂引起化疗后恶心呕吐反应的研究进展[J].中华全科医学，2017，15（2）：321-324.
　　[4] [H]GPT1-1.化学药物急性毒性试验技术指导原则[S].《化学药物急性毒性试验技术指导原则》课题研究组，2005.
　　[5]李颖，刑斌，姚秀娟，等.一种简便的小鼠活动度的检测方法[J].西北药学杂志，1995，10（1）：27-29.
　　[6]李愛国，王鑫.中西医结合防治肿瘤化疗性呕吐40例[J].中医研究，2017，30（1）：34-36.
　　[7]董晶，王玲玲，王邦才，等.养胃和络饮联合昂丹司琼治疗乳腺癌化疗后呕吐30例[J].浙江中医杂志，2019，54（1）：53.
　　[8]张雪峰，彭云云，胡燕.预防奥沙利铂化疗后恶心呕吐方案的比较[J].贵州医药，2019，43（1）：67-69.
　　[9]梁峻立，吕文艳.帕洛诺司琼与托烷司琼对预防单节段腰椎减压植骨融合内固定手术后恶心呕吐的效果比较[J].中国当代医药，2018，25（10）：16-18，22.
　　[10]丁红，施伟伟，王治宽，等.阿瑞匹坦联合托烷司琼治疗化疗所致恶心呕吐的回顾性分析[J].癌症进展，2017，15（4）：408-410， 431.
　　[11]郝建萍.六君子汤联合托烷司琼预防乳腺癌化疗呕吐不良反应的疗效观察[J].中国医药指南，2018，16（35）：177.
　　[12]崔艳东.加味小半夏汤防治肿瘤化疗后恶心、呕吐40例疗效观察[J].湖南中医杂志，2018，34（12）：49-50.
　　[13]高春明，张武，黄文彬.旋覆代赭汤加减联合盐酸格拉司琼防治化疗性恶心呕吐的效果探讨[J].数理医药学杂志，2019，32（2）：237-238.
　　[14]王艳红，王鋆泉，王芳.穴位注射氟哌利多对预防肺癌术后化疗患者恶心呕吐的影响[J].首都食品与医药，2019，26（2）：43-44.
　　[15]王晓艳，李志华.中医穴位贴敷技术对癌症患者化疗后恶心呕吐的防治效果[J].四川中医，2019，37（1）：189-190.
　　[16]周爱春，刘云霞，陈丽娟，等.穴位贴敷防治骨肉瘤患者化疗后恶心呕吐43例[J].浙江中医杂志，2018，53（12）：884-885.
　　[17]李娜，钟云萍，孙圣荣.渐进式肌肉放松训练缓解乳腺癌化疗期恶心呕吐的效果[J].上海护理，2019，19（1）：10-13.
　　[18]黄妹妹，罗瑞君.放松训练对化疗患者预期性恶心呕吐的效果观察[J].护士进修杂志，2019，34（2）：171-172.
　　收稿日期：2019-3-11;修回日期：2019-3-29
　　编辑/肖婷婷
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