芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理变化及免疫功能的影响

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　　 摘要：目的  观察芍药汤对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠组织病理变化及免疫功能的影响，探究其对UC大鼠的免疫调节机制。方法  采用TNBS诱导制作UC模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组和芍药汤组，各给药组给予相应药物灌胃，连续7 d。观察大鼠一般状况、体质量、结肠组织大体形态、结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分，HE染色观察结肠组织病理变化，ELISA检测血清白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4含量，免疫组化检测结肠组织IL-1β、TNF-α、IL-4蛋白表达。结果  与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P<0.01），CMDI评分、血清和结肠组织IL-1β、TNF-α含量和蛋白表达显著升高（P<0.01），IL-4含量和蛋白表达显著降低（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠体质量显著升高（P<0.05），结肠组织一般形态和病理变化显著改善，CMDI评分、血清和结肠组织IL-1β、TNF-α含量和蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01），IL-4含量和蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。结论  芍药汤能有效改善UC模型大鼠结肠组织一般状况及病理变化，提高机体免疫功能，其机制可能与调节IL-1β、TNF-α及IL-4等细胞因子的含量和蛋白表达相关。
　　 关键词：芍药汤;溃疡性结肠炎;结肠病理变化;免疫功能;大鼠
　　 中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）06-0059-05
　　Abstract： Objective To observe the effects of Shaoyao Decoction on colonic pathological changes and immune function in rats with ulcerative colitis （UC） induced by TNBS; To explore its immunoregulatory mechanism for UC rats. Methods A model of UC was induced using TNBS. SD rats were randomly divided into normal group， model group， mesalazine group and Shaoyao Decoction group. Each administration group was given relevant medicine for gavage for 7 d. The general condition， body weight change， gross morphology of colon tissue and CMDI score were observed. HE staining was used to detect pathological changes of colon tissue. Serum levels of IL-1β， TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Immunohistochemistry was performed to detect the expressions of IL-1β， TNF-α and IL-4 protein in colon tissue. Results Compared with the normal group group， body weight of the rats in model group significantly decreased （P<0.01）. The CMDI score， the contents and protein expressions of IL-1β and TNF-α in serum and colon tissue increased significantly （P<0.01）， and the content and protein expression of IL-4 decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， body weight of the rats in Shaoyao Decoction group and mesalazine group significantly increased （P<0.05）， and the general morphology and pathological changes of the colon
　　 潰疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种原因不明的慢性炎症性疾病，其发病机制复杂，涉及遗传易感性、上皮屏障缺陷、失调的免疫应答和环境因素[1]，属中医学“久痢”“血痢”“肠风下血”等范畴。芍药汤出自刘完素《素问病机气宜保命集》，其云本方之治法为“行血则便脓自愈，调气则后重自除”，后世医家皆推芍药汤为治疗湿热痢疾之主方，多有较好的疗效。鉴于辨病是辨证的前提，“方病对应”是“方证对应”和“病证结合”的基础[2]，本实验观察芍药汤对UC大鼠结肠组织病理变化及免疫功能的影响，探究其对UC大鼠的免疫调节机制。
　　1  实验材料
　　1.1  动物
　　 SPF级SD大鼠40 只，雌雄各半，体质量150～170 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物房，温度24～26 ℃，相对湿度50%～70%，自由摄食饮水，适应性喂养3 d。 　　1.2  药物
　　 芍药汤（白芍30 g，黄芩15 g，黄连15 g，大黄9 g，槟榔6 g，木香6 g，当归15 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经水煮、浓缩、过滤，浓缩成2 mg原药材/mL药液，置于4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪缓释颗粒剂，上海爱的发制药集团，0.5 g/袋，批号20160316。
　　1.3  主要试剂与仪器
　　 HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号C0105），10%水合氯醛（天津市凯信公司，批号20170328），TNBS（美国Sigma，批号3LBD6811V）;白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4 ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号201803），兔抗鼠IL-1β、TNF-α、IL-4抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号BC025840、BC025786、BC025786），辣根酶标记羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZB2306）。酶标仪（北京普朗新技术有限公司），洗板机（芬兰Thermo Labsystems），微量高速离心机（型号TG16W，长沙湘智离心机仪器有限公司），隔水式恒温培养箱（型号GNP-9080，常州创威实验仪器厂），光学扫描显微镜（日本Olympus），2235型精密轮转切片机（德国LEICA）。
　　2  实验方法
　　2.1  造模
　　 参照文献[3]方法制作UC模型。造模前大鼠禁食24 h，10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，用石蜡油润滑直径0.4 mm软管，插入直肠，深约8 cm，注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，再将大鼠提尾倒置60 s，使药液充分停留结直肠内。正常组给予等体积生理盐水灌肠。清醒后自由饮水，造模后连续1周从体质量变化、大便形状、便血情况、内脏敏感性、结肠病理等方面进行模型评价。造模7 d后随机抽取2只大鼠解剖，结肠病理显示充血、水肿、炎性细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化，提示造模成功[4]。
　　2.2  分组和给药
　　 实验大鼠采用随机数字法分为正常组、模型组、美沙拉嗪组（0.067 g/kg）和芍药汤组（1.800 g/kg），每组10只，雌雄各半。美沙拉嗪组和芍药汤组于造模后7 d开始灌胃给药，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。每日1次，2 mL/次，连续7 d。各药均以蒸馏水作溶剂配制，以60 kg成人每日服用药物剂量与160 g大鼠体表面积换算比值换算出大鼠1 d用量，计算各给药组临床等效剂量[5]。
　　2.3  标本采集和检测
　　 末次给药后禁食、禁水24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，采血后脱颈处死大鼠，收集血液、结肠组织等进行指标检测，-20 ℃冰箱保存备用。
　　2.4  一般观察
　　 自肛门处向上取结肠（8±2）cm，沿纵轴剪开，用生理盐水冲洗干净，并进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分。0分为无损伤;1分为轻度充血、水肿，无溃疡;2分为肠壁变厚，无溃疡;3分为有溃疡（直径<1 cm）;4分为有溃疡（直径>1 cm），肠管与周围组织无粘连;5分为有溃疡（直径>1 cm），肠管与周围组织有粘连[6]。
　　2.5  结肠组织病理觀察
　　 4%多聚甲醛固定结肠组织，经脱钙、脱水，石蜡包埋，切片（厚约4～5 μm），二甲苯脱蜡，无水乙醇水合，HE染色固定，镜下观察组织学变化。
　　2.6  血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4含量检测
　　 取大鼠抗凝全血，4 ℃、2500 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测。于酶标仪波长450 nm处测定吸光度（A），根据待测样品A值计算相应IL-1β、TNF-α、IL-4的含量。
　　2.7  结肠组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4蛋白表达检测
　　 取1 cm3大鼠结肠组织，4%多聚甲醛中固定30～60 min，PBS洗涤2次，50 ℃脱水，石蜡包埋，切片（厚约4 μm）。将所有样品脱蜡、水合、灭活、抗原修复处理。5%牛血清白蛋白封闭切片20 min，再与一抗IL-1β（1∶500）、TNF-α（1∶500）、IL-4（1∶500）37 ℃温育1 h，PBS洗涤，将切片与二抗羊抗兔IgG（1∶1000）于20～37 ℃温育20 min，经显色、洗涤、脱水、透化、固定后，镜下观察。应用Motic Advanced 6.0图像分析系统分析。
　　3  统计学方法
　　 采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，对样本先进行正态性检验、方差齐性检验，方差齐用LSD法进行组间多重比较，方差不齐用非参数秩和检验，用Kruskal-Wallis H test比较总差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4  结果
　　4.1  一般状况
　　 造模后1 d大鼠表现精神沉郁，毛发无光泽，耸毛，蜷缩，活动减少，并伴黏液便、血便及体质量下降，造模大鼠有1～2只于造模后7 d内死亡。与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组体质量显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠体质量无显著变化（P>0.05）。见表1。
　　4.2  结肠组织大体形态变化 　　 模型组大鼠结肠肉眼可见明显充血、水肿，伴见不同程度黏膜糜烂和溃疡，溃疡处肠内容物嵌入，结肠病变处肠腔不同程度扩张变形（见模型组A图）;部分大鼠结肠表面有灰黑色伪膜，肠腔扩张变形明显，结肠与周围组织粘连明显，不易分离（见模型组B图），严重者可出现大段结肠全层改变（见模型组C图）;芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠结肠与周围组织粘连较轻，轻度充血、水肿，结肠黏膜轻度糜烂，肠腔内溃疡范围小、数量少，且溃疡呈愈合性表现。见图1。
　　4.3  芍药汤对模型大鼠结肠黏膜损伤指数的影响
　　4.4  结肠组织病理变化
　　 正常组大鼠结肠组织未见或少见炎性细胞浸润;模型组大鼠结肠组织黏膜明显充血、水肿，广泛炎性细胞浸润，杯状细胞减少，溃疡周围腺体缺损且分布杂乱，肠壁广泛纤维化，病变深达黏膜下层、肌层甚至浆膜层，可见炎性肉芽肿;芍药汤组和美沙拉嗪组较模型组大鼠结肠病理改变明显改善，表现轻度充血、水肿，炎性细胞浸润减少，炎性细胞浸润层次变浅，主要集中在黏膜层、黏膜下层，肠壁少量纤维化，部分结肠溃疡周围可见新生腺体，肠壁内可见新生的杯状细胞及肠黏膜层，呈愈合性改变。见图3。
　　4.5  芍药汤对模型大鼠血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4含量的影响
　　 与正常组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著升高，IL-4含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著降低，IL-4含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4含量无显著改变（P>0.05）。见图4。
　　4.6  芍药汤对模型大鼠结肠组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4蛋白表达的影响
　　 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著升高，IL-4蛋白表达显著下降，（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著降低，IL-4蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α、IL-4蛋白表达无显著改变（P>0.05）。见图5～图8。
　　5  讨论
　　 临床上，中医治疗UC有着独特优势，《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》将芍药汤确定为治疗大肠湿热证的主方[7]。
　　 近年来，肠黏膜免疫功能紊乱在UC发病中的作用愈发受到重视，促炎细胞因子/抗炎细胞因子的失衡是肠黏膜免疫功能出现紊乱的重要原因[8-9]。促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4的作用日益凸显。IL-1β通过自分泌或旁分泌方式引起TNF-α、IL-6、IL-8等炎症递质的产生，使局部组织出现急性炎症，进而引起结肠组织充血、水肿、溃疡和坏死等病变[9];而IL-4不仅能抑制炎症的发生、发展，还有一定的免疫抑制功能，故在维持肠黏膜内环境的稳定中至关重要[10]。UC患者血清中IL-1β、IL-4、TNF-α含量可作为评估UC患者病情及预后的重要指标。
　　 本研究发现，TNBS造模后，模型组大鼠一般状况及体质量明显下降，CMDI评分明显升高，结肠组织出现不同程度的病理损伤，该变化符合UC改变，芍药汤能不同程度提升UC大鼠的一般状况和体质量，降低CMDI评分，改善结肠大体形态学及病理损伤，作用与美沙拉嗪无明显差异，提示芍药汤能显著改善UC大鼠的一般形态变化及病理损伤;另外，造模后大鼠血清及结肠组织IL-1β、TNF-α水平升高，IL-4水平降低，给予芍药汤干预，大鼠血清及结肠组织IL-1β、TNF-α的含量和蛋白表达显著降低，IL-4含量和蛋白表达显著升高，效果与美沙拉嗪相当，提示芍药汤改善机体免疫功能可能与调节IL-1β、TNF-α及IL-4等细胞因子的含量和蛋白表达相关，进而减轻结肠组织损伤。
　　 综上所述，芍药汤能显著改善TNBS诱导的UC大鼠结肠组织一般形态及病理变化，并通过影响细胞因子的表达水平，发挥对机体免疫功能的调节作用。鉴于芍药汤临床应用广泛，深入探究芍药汤治疗UC的机制将为临床应用提供依据。
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　　（收稿日期：2018-12-04）
　　（修回日期：2019-01-11;编辑：华强）
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