干细胞在皮肤创面修复应用中的研究进展

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　　[摘要]创面修复是皮肤科和整形外科常见的临床问题，干细胞具有自我更新以及多向分化潜能，近年来，在皮肤创面修复领域受到广泛关注。通过将干细胞与促进细胞增殖的细胞因子联合使用，或利用基因工程技术以及使用干细胞制作组织工程皮肤等新技术，不仅丰富了干细胞的治疗手段，而且提升了干细胞修复创面的能力。该文对近年表皮干细胞、间充质干细胞、毛囊干细胞及间充质干细胞外囊泡在皮肤创面修复领域的相关研究进展综述如下。
　　[关键词]干细胞;皮肤;再生;组织工程;创面修复
　　[中图分类号]R322.99     [文献标志码]A   [文章编号]1008-6455（2019）06-0159-05
　　Abstract： Wound repair is a common clinical problem in dermatology and orthopedics. The stem cells have self-renewal and multi-directional differentiation potential，and have received widely attention in the field of skin wound repair in recent years. The combination of stem cells with cytokines， or the use of genetic engineering techniques and tissue-engineered skin not only enrich the treatment of stem cells， but also enhance the ability of stem cells to repair wounds. In this paper， the research progress of epidermal stem cells， mesenchymal stem cells， hair follicle stem cells and mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in the field of skin wound repair has been reviewed.
　　Key words： stem cell; skin; regeneration; tissue engineering; wound repair
　　干細胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，成体干细胞同样具有较强的多向分化潜能，在一定条件下可以分化为骨、肌肉、脂肪、血管、肝脏、神经及上皮等多种组织细胞[1]。目前，对干细胞在创面修复中研究较多的有表皮干细胞、间充质干细胞及毛囊干细胞等，本文就干细胞在创面修复中的相关研究进展综述如下。
　　1  表皮干细胞（Epidermal Stem Cellls， ESC）
　　表皮干细胞来源于胚胎的外胚层，是各种表皮细胞的祖细胞，在特定微环境下还可被诱导分化成皮肤附属器。表皮干细胞位于表皮基底层，具有慢周期性、自我更新增殖能力及对基底膜黏附的特点。随着年龄的增长，表皮的弹性、厚度、增殖及免疫等在一定程度上受到影响，但表皮干细胞的数目、功能、基因表达和分化反应性等始终保持稳定的水平。肖静等[2]采用溴脱氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxy Uridine，Brd U）标记追踪ESCs，发现在创面修复过程中，ESCs能够通过向创缘迁移并增殖，主动参与创面的修复，是创面上皮化的重要来源。
　　糖尿病创面难以愈合的原因之一是糖尿病高糖状态通过抑制磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl Inositol 3-Kinase，PI3K）的磷酸化而使ClC-2型氯通道（简称ClC-2）的表达下降，进而抑制了ESC的迁移能力[3]。常飞等[4]发现局部单用神经生长因子或胰岛素治疗糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面，可使表皮中ESCs增多，提高创面愈合率，而神经生长因子和胰岛素联合组表皮中ESCs的表达较单用组高，创面中皮岛出现早而且数量多，创面愈合率亦明显升高，这为ESC在糖尿病创面的应用提供了理论依据。Zhao[5]研究发现细胞周期蛋白D1过表达诱导分化的表皮细胞，具有表皮干细胞的形态学、表型和功能特征，可以加速实验动物伤口愈合。这提供了一种新方法来产生用于伤口修复和再生的表皮干细胞。
　　在孕中期胎儿的全层皮肤缺损创面，主要以完全再生的方式进行修复，成人皮肤创面主要以瘢痕方式愈合。主要调控动物发育的同源异形框基因族（Paired-Related homeobox gene，PRX），尤其是PRX-2基因在胎儿皮肤中的表达水平远高于成人，而胎儿或成人皮肤ESCs主要分布的区域正是PRX-2基因阳性表达的位置。王统民[6]发现PRX-2基因过表达的成人ESCs，PRX-2蛋白表达上调，ESCs增殖速度增加，而PRX-2基因沉默的胎儿ESCs，PRX-2蛋白表达下调，ESCs增殖速度显著降低。何秀叶等[7]使用过表达PRX-2基因的ESCs制作的组织工程皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损创面，见胶原生成较多，排列较规则，肉芽组织生长良好，并有部分皮肤附件产生，创面愈合情况较对照组好。代涛等[8]采用自体表皮干细胞膜片修复巨痣切削术后创面缺损10例，对照组行自体刃厚皮片移植。实验组创面愈合时间比对照组明显缩短，随访发现在瘢痕增生或挛缩、皮肤色泽及弹性等皮肤功能方面表现良好。综上，ESCs对维持表皮的自我更新和增殖潜能、保持皮肤的正常结构起着重要作用，而且PRX-2可促进ESCs的增殖，为ESCs的研究应用提供了新思路。
　　2  间充质干细胞（ Mesenchymal Stem Cells， MSCs） 　　间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，取材方便，容易扩增，免疫源性低。当组织血管化受损时，间充质干细胞通过分泌基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-Derived Factor-1，SDF-1）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF）、胰岛素样生长因子、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor， EGF）、干细胞因子等多种细胞因子刺激内皮祖细胞的动员、扩增以及分化，促进干细胞分裂，血管新生、组织再生及减弱瘢痕形成，而促进创伤愈合[9]。
　　2.1 骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells， BMSCs）：BMSCs最早于1968年，由Friedenstein等培养全骨髓细胞时发现，能分化为多种间充质组织。SDF-1及其膜受体CXC趋化因子受体4型（CXC Chemokine Receptor4，CXCR4）参与多种干细胞的归巢和迁移、细胞增殖和血管生成。SDF-1是唯一能与CXCR4结合并激活的天然趋化因子。在创伤愈合过程中，SDF-1/CXCR4信号轴诱导MSCs迁移到创伤部位，并诱导其分泌VEGF、促纤维生长因子和TGF-β等多种生长因子，形成许多血管网，参与伤口修复，过表达CXCR4的BMSCs迁移能力增强，可加速伤口愈合[10]，而阻断CXCR4会减弱BMSCs迁移能力。BMSCs可以提高糖尿病大鼠足溃疡创面VEGF水平和小血管数目来加速创面愈合，BMSCs复合EGF还可促进大鼠β射线皮肤损伤创面的愈合[11-12]。池凯等[13]发现用BMSCs和脱细胞真皮基质（Acellular Dermal Matrix，ADM）构建组织工程皮肤对小鼠背部全层皮肤缺损创面具有很好的促愈合作用。王琦等[14]使用BMSCs联合微粒皮或自体小皮片移植治疗猪全层皮肤缺损，BMSCs能促进移植创面的微粒皮、小皮片组织成活，调节TGF-β1和TGF-β3的表达，促进创面愈合。BMSCs加微粒皮或自体小皮片组，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达高于单用BMSCs组，提示单纯骨髓间充质干细胞治疗还不能取代传统的微粒皮和小皮片植皮。
　　2.1.1 BMSCs标记和监测技术：昕桐等[15]发现超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记后的BMSCs在磁场作用下，能向创面聚集并促进创面愈合。这种磁性颗粒具有超顺磁性、低毒性、良好生物相容性及在外加磁场下定向移动等特点，在细胞标记、药物靶向投递及肿瘤治疗等方面都有广泛应用[16]。Oh EJ等[17]用表达萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，FLuc）的MSCs静脉注射到烧伤小鼠，结果显示MSC可以促进伤口愈合，而且利用Fluc基因的光学成像可以非侵袭性地在动物模型中监测MSC迁移到烧伤部位。Chu[18]将绿色萤光蛋白标记的BMSCs与从正常小鼠ADM支架共培养后，移植到糖尿病小鼠的全层皮肤伤口，采用多光子显微镜同时采集I型胶原纤维的光学二次谐波图像和荧光化合物的双光子激发荧光图像，以监测和评估伤口愈合。结果发现局部移植MSC-ADM可有效促进糖尿病皮肤创面的愈合，促进血管生成和快速再上皮化。多光子显微镜是一种无创的三维结构成像方法，为研究干细胞的功能监测提供了更为便利的手段。
　　2.1.2 BMSCs修复能力的提升：干细胞移植治療技术在临床应用过程中仍然存在许多缺陷和不足，其最关键问题是分离培养的干细胞在体外会遭遇多次氧化应激损伤。研究发现用低浓度H2O2（50μmol/L）预处理BMSCs，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥抗凋亡活性，能显著增强BMSCs抗氧化应激损伤能力，将低浓度H2O2预处理的干细胞移植治疗创面，能增强其在创面的生存能力，并能显示出更佳的促愈效果[19]。此外，移植BMSCs的存活能力差，分化成所需细胞类型的能力有限，常常阻碍其应用。Shou等[20]利用甲壳素纳米纤维（Chitin nanofiber，CNF）水凝胶在体外诱导BMSCs分化，可降低BMSCs转录因子（Oct4和Klf4）的表达，诱导其分化为创伤再生所必需的血管生成细胞和成纤维细胞。在体内，用BMSCs水凝胶处理的大鼠全层皮肤伤口比局部注射BMSCs的伤口显示出更好的细胞活性，促进肉芽组织形成，加速创伤修复。CNF水凝胶不仅提高了外源性BMSCs的存活能力，而且提供一种能够增强BMSCs再生潜力以促进伤口愈合的功能支架。这可能有助于克服目前在创伤再生领域所面临的干细胞治疗的局限性。
　　通过药物的预刺激也能提升BMSCs的修复能力。Yang Z等[21]使用姜黄素预处理BMSCs移植治疗皮肤创伤，结果显示姜黄素能促进BMSCs的增殖，改变纤维连接蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量和比例，表皮厚度和胶原沉积更接近正常皮肤，此外姜黄素还能产生大量SDF-1，促进大量白细胞迁移，调控TH1细胞和M1巨噬细胞而创造良好的免疫微环境。鸡胚提取物（Chicken embryo extract，CEE）是许多刺激细胞增殖的生长因子的丰富来源，BMSCs和CEE单独或联合应用于随机皮瓣大鼠模型，对皮瓣存活率和血管数量都有促进作用，而BMSCs治疗产生的肥大细胞对缺血组织模型中的皮瓣存活具有抑制作用[22]。因此，在BMSCs治疗缺血性皮瓣的研究中，应该使用肥大细胞稳定剂和分析肥大细胞颗粒，以找到更有效的给药途径。
　　2.1.3 BMSCs临床应用：邓利娟等[23]在扩血管、抗感染及营养末梢神经等常规治疗基础上，配合自体BMSCs移植治疗糖尿病足患者26例，结果移植4周后，痊愈19例，显效5例，有效2例，无效0例，总有效率为100%。徐恒等[24]对88例糖尿病足溃疡患者进行自体BMSCs移植，治疗组44例配合高压氧治疗，对照组44例采用单纯BMSCs移植治疗，治疗组跛行距离、患肢疼痛、冷感及踝肱指数、经皮氧分压及踝肱指数都得到显著改善，两组治疗后EGF、血小板衍生生长因子、血栓素B2、6酮前列腺素都有升高，但治疗组效果明显优于对照组。这说明自体BMSCs移植对糖尿病足溃疡有很好的临床疗效，配合高压氧能提高治疗效果。 　　2.2 人胎盘来源的间充质干细胞（human placenta derived Mesenchymal Stem Cells， hpMSCs）：hpMSCs分化可能性多、增殖快、免疫排斥性低、使用时无需配型，为优质的MSCs来源。秦丹莹等[25]发现hpMSCs具有较强的创伤修复能力，而转染了SDF-1的hp MSCs因其对CXCR4的趋化能力可以更好地聚集于损伤处，加速创面愈合。
　　2.3 人羊膜间充质干细胞（human Amniotic Mesenchymal Stem Cells， hAMSCs）：人羊膜是隔离胎儿和母体的一层隔膜，是产后废弃物，而且无血管、神经、淋巴等[26]。hAMSCs移植到宿主体内后分泌特定的细胞因子，调节并激活机体固有MSCs增殖、迁移、分化，移植的hAMSCs也归巢到宿主受损部位，定向增殖、分化为病变部位的组织细胞，参与创面的再生修复，预防瘢痕增生，促进皮瓣存活及神经功能重建。Ertl等[27]发现hAMSCs显著促进血管生成，诱导了伤口更快愈合，是一种新的更具前景的治疗剂。
　　2.4 人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs）：Mc Elreavey等[28]于1991年首次从人脐带沃顿胶中分离出hUC-MSCs，UC-MSCs可以向受损组织归巢，并能促进多种组织损伤的修复，如：肺、肾、肝及脊髓等[29]。Shi等[30]将UC-MSCs与皮肤微粒联合移植到小鼠全皮层损伤创面，可观察到表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺的新生成层，显著提高损伤后皮肤修复的质量。马诗雨等[31]将UC-MSCs与自体微粒皮进行混合涂抹于大鼠的背部创面，创面收缩率、新生皮肤较空白对照组好，且愈合速度快，组织中毛细血管及胶原含量明显增多且排列整齐，VEGF的表达增高。刘玲英等[32]将hUC-MSCs移植于严重烧伤大鼠，发现其能迁移归巢到创面，发挥抗炎、抗凋亡、促进血管新生以及调控Ⅰ、Ⅲ型胶原比例。hUC-MSCs的修复功能与VEGF关系密切，hUC-MSCs通过旁分泌高水平的VEGF，与内皮细胞上的VEGFR2结合，抑制下游的促凋亡蛋白Caspase-3和增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达，发挥促内皮细胞存活、增殖和抗内皮细胞凋亡的作用[33]。此外，hUCMSCs移植后会受到机体内环境的影响，使用适宜浓度（100ng/ml）血管紧张素（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）预处理的hUC-MSCs可促进其增殖，减少凋亡[33]。
　　Montanucci等[34]使用hUC-MSCs和纤维蛋白制作组织工程皮肤，将其移植至全层创伤的小鼠，创伤愈合后，出现皮肤附属器，并且能够增强伤口无显著瘢痕组织愈合，这种新方法为糖尿病足溃疡和烧伤的手术治疗提供了希望。
　　2.5 人脐带血间充质干细胞（human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells，hUCB-MSCs）：脐血是胎儿出生时经结扎脐带断脐，通过脐静脉穿刺或切开引流收集到的脐带内和胎盘靠近胎儿一侧血管内的血液。脐血中含有丰富的造血干细胞和间质干细胞。脐血干细胞具有很强的增殖、分化及形成集落的能力，受到刺激進入细胞周期的速度及对各种造血刺激因子的反应能力，均高于骨髓和外周血细胞。
　　肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）可以促进血管生成和抑制细胞凋亡。金丽娟等[35]将携带HGF的重组腺病毒（Ad-HGF）转染人脐血干细胞异体移植，显著提高了烧伤创面愈合速度和质量。干细胞的修复效果还与移植方式有关，史功等[36]发现UCB-MSCs异体移植在一定程度上可以促进免疫缺陷SCID小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合，局部移植效果优于尾静脉移植。临床方面，成纤维细胞和/或角质形成细胞组成的各种类型的皮肤替代物常用于治疗糖尿病性溃疡，但效果通常不是很显著，而Jung等[37]发现使用hUCB-MSCs处理糖尿病伤口显示出比成纤维细胞更高的细胞增殖、胶原合成和糖胺聚糖水平。hUCB-MSCs的新型商业药物已经开发出来，作为同种异体干细胞的第一细胞治疗产品，并已获得韩国食品药品管理局（FDA）批准用于促进膝关节软骨再生，这也为临床难愈性创面提供了较好的治疗策略。
　　2.6 脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cells， ADSCs）：2001年，Zuk等[38]首次从人脂肪组织中分离出脂肪组织来源干细胞。Han等[39]发现ADSCs能改善因静脉缺血再灌注损伤的皮瓣存活率。但ADSCs直接移植于创面后，由于没有任何覆盖直接与外界环境接触，细胞容易直接流失，造成细胞的损伤和死亡。而通过壳聚糖膜覆盖创面后能形成柔韧透明的薄膜，起到保护创面防止移植的ADSCs流失，从而促进创面愈合的作用[40]。Basu等[41]使用钙结合蛋白复合物S100A8/A9，一种损伤相关的分子模式（Damage Associated Molecular Patterns，DAMPs）分子预处理的ADSC注射在鼠全层伤口，能显著促进伤口愈合，这提示当暴露于危险信号分子S100A8/A9时，MSCs促进了有益的适应性反应，存活能力增强。利用DAMP预处理干细胞以增强细胞活力的处理方式，值得进一步研究。在给药途径方面，尾静脉全身应用和局部注射的创面微血管密度未发现明显差异，但比外敷更好[42]。
　　此外，联合用药也是增强干细胞修复功能的方法之一。富含血小板血浆（platelet rich plasma， PRP）凝胶联合ADSCs促进了血管化新生及增加胶原蛋白合成，可有效加速创面愈合[43]。下肢溃疡患者局部应用ADSCs和PRP后，创面愈合时间显著缩短[44]。Minjuan W等[45]将ADMSCs移植到人类无细胞羊膜上，并移植至裸鼠皮肤缺损创面，促进了小鼠全层缺损的愈合和皮肤附属物的产生。 　　2.7 真皮间充质干细胞（Dermis-derived Mesenchymal Stem Cells，DMSCs）：DMSCs来源于皮肤真皮层，在正常真皮处于相对静止的状态，创伤后被激活，参与肉芽组织形成，主要通过旁分泌和分化等多方面发挥促愈合作用。
　　2013年，Ryan[46]发现了人和小鼠胚胎真皮组织中的不同层面至少存在DLK1+/Sca1-和 DLK1-/Sca1+两种DMSCs（印记基因1：delta-like1 homologue，DLK1;干细胞抗原1：stem cell antigen-1， Sca1）。DLK1+/Sca1-细胞存在于皮肤组织下层，参与皮肤损伤修复，而DLK1-/Sca1+细胞存在于皮肤组织上层，在毛发生成中起关键作用。王登高[47]发现DLK1+/Sca1-DMSCs在小鼠皮肤线性伤口和环形切除伤口中，都比DLK1-/Sca1+DMSCs组伤口愈合快，说明DMSC促进伤口愈合的作用是基于DLK1+/Sca1-的细胞产生。
　　2.8 肉芽组织间充质干细胞（Granulation Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells， GT-MSCs）：創伤特别是严重烧伤，会产生大量的肉芽组织形成皮肤结构缺损的瘢痕，甚至造成肢体功能障碍。Pelizzo G等[48]从1名12个月大的皮肤全层烧伤接受烧伤治疗15d后的男性患者创面分离肉芽组织（Granulation tissue，GT），从GT中分离、扩增出具有典型MSCs形态、表型、增殖和分化能力的GT-MSCs。其通过释放的可溶性因子表现出抗纤维化特性，这种活性优于BMSCs，提示GT-MSCs可被认为是改善烧伤创面愈合的良好候选方案。
　　2.9 外周血间充质干细胞（Peripheral Blood-derived Mesenchymal Stem Cells，PB-MSCs）：Martinello等[49]采用同源异种的PB-MSCs处理绵羊全层皮肤缺损创面，发现其具有促进肉芽组织和新生血管形成、增加结构蛋白和皮肤附件的作用。PB-MSC可改善浅表损伤和深部损伤的创面愈合质量，而且使用安全，不引起炎症反应，取材方便。
　　3  毛囊干细胞（hair follicle stem cells， FSCs）
　　毛囊在提高皮肤创伤愈合速度、减少皮肤瘢痕形成及提高创面愈合质量中有重要作用，而在这一过程中起主要作用的是毛囊干细胞。毛囊干细胞位于毛囊上段的Bulg e区[50]（位于皮脂腺开口处与立毛肌附着处之间的毛囊外根鞘）。FSCs具有慢增殖特性并具有分化为表皮、皮脂腺和汗腺等全部皮肤内上皮细胞的潜能。所以，在皮肤创伤时，FSCs不仅参与毛囊和皮脂腺等皮肤附属器的再生，还参与表皮创面的修复[51]。
　　自体皮肤移植手术中，头皮作为供皮区可反复取皮十几次，且不易产生瘢痕，提示毛囊与创面修复的密切关系。陈杏晔等[52]发现七厘散含药血清能促进FSC的増殖，七厘散君药血竭的主要成分龙血素A可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进细胞向S期和G2期转变进，而促进FSCs増殖和分化。将BrdU标记的FSCs与毛囊成纤维细胞联合皮耐克支架构建的人工真皮构建组织工程皮肤，将其移植入裸鼠全层皮肤缺损创面，在术后各组中BrdU标记的FSC角蛋白15（cytokeratin15，CK15）、CK19和β1整合素表达阳性，随着移植时间的延长，各组标本中CK14的表达均逐渐增强，表明植入的FSC参与了新生表皮的形成。FSC参与表皮以及毛囊等皮肤附属器的更新和修复。
　　4  间充质干细胞外囊泡（Mesenchymal Stem Cells-derived Extracellular Vesicles， MSCs-EVs）
　　细胞外囊泡是由各种细胞旁分泌产生的小的球形膜结合片段，包括外泌体（exosome）、膜微粒（microparticle， MP）、微囊泡（microvesicle， MV）等可以转移包括蛋白质、mRNA和miRNA序列的生物活性分子至靶向受损组织细胞，EVs是MSCs介导细胞间通讯以增强伤口愈合的关键分泌产物之一[53]。EVs也参与细胞间通讯，促进受体细胞的发育。Hu等[54]发现ADSCs分泌的外泌体在促进皮肤组织伤口修复方面具有积极作用，并且可以通过优化成纤维细胞促进皮肤伤口愈合。BMSCs外泌体可显著促进创面愈合、胶原合成和血管化[55]。
　　Pelizzo等[56]皮内注射脂肪干细胞外囊泡（ADSCs-EV）和骨髓细胞外囊泡（BM-EV），可恢复皮肤创伤的皮肤结构，与对应的MSCs治疗相比，EVs治疗的伤口表现出更好的恢复。ADSCs-EV治疗的伤口明显优于BM-EV，EVs局部移植在皮肤伤口愈合后，再生的组织具有完整的上皮层，真皮乳头和皮肤附件。因此，MSCs-EVs代表了一种用于皮肤再生的新型“无细胞疗法”，可以克服使用天然或工程干细胞相关的障碍和风险。此外，必须进一步研究以优化MSCs的精确剂量。
　　5  小结
　　近年来，干细胞在创伤相关领域的研究进展受到越来越多的关注。目前，关于间充质干细胞的研究，特别是骨髓间充质干细胞在创面修复领域的研究较多。虽然单用干细胞也有一定的效果，但近来的研究通过将干细胞与促进细胞增殖的细胞因子等联合使用，或利用基因工程技术，在干细胞中导入目的基因，使其在创面修复的过程中表达目的基因而发挥双重功效，或使用干细胞制作组织工程皮肤等，都大大地增强干细胞的修复能力，丰富了干细胞的运用手段。目前，已有使用姜黄素、龙血竭A等中药提取物对干细胞预处理，而促进干细胞增殖的相关报道，这也证实了中药在创伤修复领域更深层次的应用。
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　　[收稿日期]2018-11-28
　　本文引用格式：刘青武，何秀娟，张金超，等.干细胞在皮肤创面修复应用中的研究进展[J].中国美容医学，2019，28（6）：159-164.
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