循环肿瘤细胞检测在乳腺癌患者中的应用研究进展

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　　[摘要]临床证实乳腺癌患者存在血液转移的情况，循环肿瘤细胞（CTC）从原发肿瘤组织中脱落后进入血液循环，并在远处组织种植和生长，促使远处转移病灶形成。早期进行循环肿瘤细胞检测对于乳腺癌患者个体化诊治方案的制定具有较好的指导意义。本文对循环肿瘤细胞检测技术以及其在乳腺癌中的应用现状进行综述。
　　[关键词]乳腺癌；循环肿瘤细胞；应用价值
　　[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0032-03
　　Progress in the application of circulating tumor cell detection in patients with breast cancer
　　HUANG Yong-hong PAN Xiao-ming YANG Tao WANG Hui-ling LYU Mian XU Chang-qiang
　　Department of Breast Thyroid Surgery， the Second People′s Hospital of Nanning City， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530031， China
　　[Abstract] Clinical evidence of blood metastasis in patients with breast cancer， circulating tumor cell （CTC） enters the blood circulation from the primary tumor tissue and grows in the distant tissue， which promotes the formation of distant metastases. Early detection of circulating tumor cells has good guiding significance for individual diagnosis and treatment of breast cancer. In this paper， the technique of circulating tumor cell detection and its application in breast cancer are reviewed.
　　[Key words] Breast cancer； Circulating tumor cells； Application value
　　乳腺癌是一種发病率高的妇科恶性肿瘤[1]，该病的诊断及治疗效果随着临床诊治技术的提高以及设备的更新而不断提升[2]。乳腺癌患者的死亡多与远处转移相关联，且超过90%的癌症患者都是因循环肿瘤细胞经血液传播而出现的远处转移，传统的检测技术不能够检测到独立肿瘤细胞的转移过程，当血液和骨髓被入侵时，会出现远处转移的先兆，对血液和骨髓中的肿瘤细胞进行检测是癌症研究中的重要热点，而循环肿瘤细胞作为一种“液体活检”标志物，可对乳腺癌的疗效进行评估。本文对循环肿瘤细胞进行概述，并对循环肿瘤细胞检测技术、应用价值进行综述。
　　1循环肿瘤细胞的概述
　　循环肿瘤细胞的概念最先出现为1896年，由Ashworth提出；在1976年，Nowell修正了循环肿瘤细胞的定义，定义为脱落于原发肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称[3]，不仅会导致癌症患者在治疗后出现复发、远处转移等情况，还会提高癌症患者的死亡率。
　　循环肿瘤细胞的作用机制为：肿瘤转移向原发肿瘤细胞附件相关组织、淋巴管系统、血液入侵，之后形成循环肿瘤细胞，经血液或淋巴扩散后，达到远端组织，进行播种、定植和生长，出现远处转移灶[4]。
　　2循环肿瘤细胞检测技术
　　2.1富集与分离技术
　　2.1.1抗原抗体反应技术 上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecular，EpCAM）的表达在循环肿瘤细胞检测技术中十分重要，其作为一种上皮特异性蛋白，用于阳性筛选、阴性筛选中均可以富集循环肿瘤细胞，其中临床多采用淋巴细胞标记物CD45、粒细胞标记物CD15，再利用免疫磁性技术进行细胞筛选[5]，去除血液样本中的淋巴细胞。
　　2.1.2基于细胞大小的富集 按照血液样本流过微通道流速的不同，可划分成不同的亚群。循环肿瘤细胞的体积大于正常的血液细胞，结构不会出现太大的变化，流速稳定[6]，经过微通道后，可在收集区分离循环肿瘤细胞。螺旋生物芯片的微流体设备可高度控制血流，因此在全血样本中可检测到比率较高的乳腺癌细胞，但是血凝块和气泡会对精密的微流体设备造成影响。临床目前正在验证一种双向电泳分离循环肿瘤细胞的新技术的有效性。细胞作为一种电绝缘体，在不同的电场中，对液体进行作用时出现极化情况，变成一种电介质粒子。双向电泳设备可极化血液样本中的细胞，将其向收集区移动，该技术的敏感性高，甚至可分离单一的循环肿瘤细胞[7]。
　　2.1.3密度梯度离心 通过OncoQuick仪器或者是黏性液体淋巴细胞分离液中不同的离心迁移度，能够从其他血细胞中将单核细胞（包括循环肿瘤细胞）进行分离。循环肿瘤细胞的浮力小于外周血单核细胞[8]，因此可富集循环肿瘤细胞。密度梯度离心技术可快速富集循环肿瘤细胞，并将其从血细胞中分离出来，但是分离出的循环肿瘤细胞中会出现较多混杂的淋巴细胞[9]，经过离心后，很难精确分离单核细胞层。该技术的优点在于细胞回收率高，且操作简单、经济性和实用性高，对设备的要求不高，适合推广应用在临床中。 　　2.2细胞鉴定技术
　　2.2.1免疫细胞化学方法（ICC） ICC的原理为根据免疫学原理，利用抗体和特定抗原专一结合的反应，对抗原进行定位测定的技术，可对是否存在肿瘤细胞进行判断。ICC的敏感度区间为105～106[10]，操作简单且具有较好的直观性。循环肿瘤细胞的分离可通过上皮特异抗原而实现。
　　2.2.2流式细胞技术（FCM） FCM的原理在于肿瘤细胞特异性标志物结合标记荧光物质的单克隆抗体，使用流式细胞仪对染色后的肿瘤细胞进行检测和分析，进行多参数、快速的定量分析[11]，可有效检测乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞。流式细胞仪可定量循环肿瘤细胞亚群，并将其特征化。
　　2.2.3反转录聚合酶链式反应（RT-PCR） RT-PCR是通过检测mRNA的特异性来判断是否存在肿瘤细胞。RT-PCR可将血液样本中溶解的细胞是否含有循环肿瘤细胞分子进行确定，循环肿瘤细胞的mRNA反转录生成cDNA，利用PCR可进行扩增，可根据PCR反应结果对循环肿瘤细胞于样本中的数目、表达方式进行预估[12]。RT-PCR技术具有敏感性高、特异性高以及自动化的特点，采用多重mRNA标记物可对循环肿瘤细胞、正常血细胞进行较好地鉴别诊断。但是RT-PCR技术仍存在不足之处，例如其会破坏循环肿瘤细胞，无法观察循环肿瘤细胞的形态学和计数。
　　2.2.4激光扫描细胞计量技术（LSC） LSC是一种具有图像细胞仪功能、流式细胞仪功能的高通量细胞分析仪，通过进行连续扫描荧光显微镜下的图像，可对所产生的数据进行自动分析。LSC技术通过显微镜可在30 min～1 h内自动筛查5×104个细胞。当LSC技术结合浓聚细胞技术时，经荧光染色可提高敏感度。
　　2.3 CTC芯片技术
　　CTC芯片技术于2007年提出，是在微流平台上采用的微芯片技术，在精确操控的层流条件下利用包裹EP-CAM抗体的微柱将循环肿瘤细胞从循环血中进行分离，该技术应用在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤患者的循环血中均成功检测出了循环肿瘤细胞。随着临床的进一步研究，Herringbone-chip的出现促使循环肿瘤细胞与抗体接触的机会大大增加，从而使循环肿瘤细胞检出率大幅提高。分析其原理在于：基于癌细胞尺寸的捕获与分离法、片上介电电泳法以及细胞亲和微层析法等。
　　3循环肿瘤细胞检测技术在乳腺癌中的应用
　　3.1循环肿瘤细胞作为乳腺癌预后标志物
　　3.1.1早期乳腺癌循环肿瘤细胞检测 循环肿瘤细胞数目为独立的预后指标之一，且循环肿瘤细胞检出绝对值的高低可对乳腺癌患者的预后进行判断，成负相关关系。循环肿瘤细胞可作为早期无症状乳腺癌患者的常规检查项目，根据结果对乳腺癌患者进行相应的治疗。另外乳腺癌患者新辅助化疗前检出循环肿瘤细胞可促进其预后的改善，循环肿瘤细胞同PCR结合有助于对患者进行分层治疗干预。
　　3.1.2晚期乳腺癌循环肿瘤细胞检测 临床普遍认为循环肿瘤细胞计数是转移性乳腺癌的重要预后标志物，其数目可预测患者的无进展生存情况、生存期。边莉等[13]学者提出，若是转移性乳腺癌患者每7.5 ml外周血中的循环肿瘤细胞计数超过5个，则可判断该类患者的预后较差。随着临床对于循环肿瘤细胞的进一步研究，对乳腺癌循环肿瘤细胞簇的认知逐渐加深，认为其可对单个循环肿瘤细胞的转移风险进行判断，且风险性高出23～50倍，乳腺癌患者的预后越差，循环肿瘤细胞簇数目越多。分析转移性乳腺癌患者富集的循环肿瘤细胞，发现TP53基因突变最为常见，且会导致乳腺癌患者的预后变差。
　　3.2循环肿瘤细胞检测与治疗方案的选择
　　3.2.1循环肿瘤细胞检测同化疗方案的选择 循环肿瘤细胞检测具有无创性，可对药物治疗的效果进行持续动态监测，便于进行随访和进一步的研究。在接受1个周期的化疗后，乳腺癌患者的循环肿瘤细胞数目会出现改变，可对化疗的短期疗效进行判断。通过对化疗后循环肿瘤细胞检测数目变化进行分析，可对化疗方案进行调整，选择更加合理的化疗方案进行个体化治疗，从而促进患者临床疗效的提高。
　　3.2.2循环肿瘤细胞检测同HER-2靶向治疗 在HER-2扩增型乳腺癌患者的标准治疗中，曲妥珠单克隆抗体为其中的一部分，辅助曲妥珠单克隆抗体治疗可获得较多的获益，可将微小残余病灶消除，促使肿瘤耐药性降低。循环肿瘤细胞作为代表性的微小残余病灶，其数目的减少说明微小残余病灶的减少；HER-2过度表达的循环肿瘤细胞在增殖过程中会出现HER-2表达改变（获得或丢失）的情况，而HER-2阴性细胞更多是出现获得HER-2表达，因此采用循环肿瘤细胞检测技术可为HER-2靶向治疗提供新的治疗思路。
　　3.2.3循环肿瘤细胞检测同内分泌治疗 目前临床尚未统一采用化疗或内分泌治疗激素受体为阳性的转移性乳腺癌患者的量化指标，在循环肿瘤细胞数目指导下的一线治疗选择，如他莫昔芬、氟维司群联合HSP90抑制剂具有较好的耐药性和有效性，采用循环肿瘤细胞检测技术可对内分泌治疗耐药机制进行分析，并为临床治疗策略的选择提供参考。
　　3.3循环肿瘤细胞检测在乳腺癌疗效和预后评估中的作用
　　較多的乳腺癌患者由于在术后无可测量的病灶，因此不能有效评估辅助治疗的效果。循环肿瘤细胞检测可评估乳腺癌患者治疗过程中的效果，同时可评估病情进展，对疾病进展加强控制。陈海涛等[14]在某一项研究中提到，治疗后，每7.5 ml外周血中循环肿瘤细胞数目>5个的乳腺癌患者，同循环肿瘤细胞数目<5个的患者进行比较，病情进展率更高，且倍数>5倍，充分地说明了循环肿瘤细胞的存在可判断临床疗效，两者之间存在联系。谢宁等[15]在《循环肿瘤细胞在40例晚期转移性乳腺癌患者中的检测意义》一文中写道，CTC≥5个/7.5 ml的复发转移性乳腺癌患者与CTC<5个/7.5 ml的患者进行比较，肝脏转移、骨转移、转移灶>3处的阳性率更高，但前者的预后效果更差，较好地证明了上述观点的真实性。 　　单海琳等[16]于《血循环肿瘤细胞检测在中晚期乳腺癌疗效评价及转移监测中的应用》一文中提及，中晚期乳腺癌患者的CTC数目随着化疗周期的增加而不断减少，CTC阴性乳腺癌患者在化疗结束后3、6、9个月的转移复发率均高于CTC阳性乳腺癌患者，较好地提示了循环肿瘤细胞检测应用于转移监测中具有较好的效果，可对乳腺癌患者的预后进行预测。
　　4小结
　　循环肿瘤细胞检测技术对于乳腺癌个体化治疗方案的实施具有良好的促进作用，但该检测技术在临床中的普及还存在以下解决的问题：①应用上皮细胞特异性抗原进行循环肿瘤细胞检测，可能会导致出现上皮细胞-间充质转化的肿瘤细胞遗漏；②RT-PCR技术对循环肿瘤细胞的破坏会影响其计数，无法进行表型分析；③循环肿瘤细胞数目过少促使临床对标本量具有较高的需求，对临床的可重复性操作造成限制。但是循环肿瘤细胞检测技术的临床应用价值仍较高，以后临床研究中应注意解决上述问题，为乳腺癌患者提供理想的个体化治疗方案，具有广阔的应用前景。
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　　（收稿日期：2018-11-15 本文编辑：闫 佩）
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