自噬调节EMT过程在间质性肺病中的作用机制探讨

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　　[摘要] 目的 研究不同阶段肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬变化，并通过增强自噬水平，观察自噬对间质性肺炎上皮细胞-间充质转化（EMT）的作用与调控机制。 方法 将小鼠随机分为A空白对照组、B模型组、C自噬增强组各10只。B组及C组气道滴注BLM建立模型，C组腹腔注射mTOR-siRNA。各组分别于干预第7天及第14天随机处死3只小鼠，第28天处死剩下的4只小鼠。记录每只小鼠体重。各组取肺组织进行电镜检查，计数肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体数量，测定不同时期的小鼠肺泡组织中的Smad3、Smad7表达。 结果 模型7 d组自噬体有所增加，模型14 d、28 d组较空白对照14 d、28 d组无明显变化;自噬增强组各时间组可减轻小鼠肺泡炎及纤维化程度;第14、28 d比较：自噬增强组小鼠Smad3蛋白表达较肺间质纤维化模型组明显降低（P<0.01），较空白对照组小鼠增高（P<0.01）;自噬增强组 Smad7 蛋白表达较肺间质纤维化模型组增加（P<0.05），相比空白对照组低（P<0.01）。自噬增强组的各阶段的肺泡炎和肺纤维化程度与模型组（B组）对比减轻（P<0.05）（除肺纤维化7 d组比较外）。 结论 肺泡Ⅱ型上皮细胞的自噬变化对 EMT 具有重要调控作用，mTOR-siRNA可通过调节Smad 信号通路参与 EMT 过程的发生，减少肺间质纤维化形成。
　　[关键词] 间质性肺疾病;自噬;肺泡 Ⅱ 型上皮细胞;上皮细胞-间充质转化
　　[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-9701（2020）03-0030-05
　　[Abstract] Objective To study the changes of autophagy in alveolar type Ⅱ epithelial cells at different stages， and to observe the effect and regulation mechanism of autophagy on epithelial-mesenchymal transition（EMT） of interstitial pneumonia via enhancing autophagy level. Methods Mice were randomly divided into blank control group A， model group B and autophagy enhancement group C， with 10 mice in each group. Models of airway drip BLM were established in group B and group C. Group C was injected intraperitoneally with mTOR-siRNA. Three mice were randomly sacrificed on the 7th and 14th day of intervention in each group. On the 28th day， the remaining 4 mice were sacrificed. The body weight of each mouse was recorded. The lung tissue was collected for electron microscopy in each group. The number of autophagosomes in alveolar type Ⅱ epithelial cells was counted， and the expression of Smad3 and Smad7 in mice alveolar tissues at different stages was determined. Results The autophagosomes in the 7-day model group were increased， and the 14-day and 28-day model groups did not change significantly compared with the 14-day and 28-day blank control groups. The degree of alveolitis and fibrosis in mice could be alleviated in the autophagy enhanced group at each time; the comparison of 14 th and 28 th day： the expression of Smad3 protein in the autophagy enhanced group was significantly lower than that in the pulmonary interstitial fibrosis model group（P<0.01）， which was higher than that in the blank control group（P<0.01）; the expression of Smad7 in the autophagy enhanced group was higher than that in the model group at each stage（P<0.05）， which was lower than that in the blank control group （P<0.01）. The degree of alveolitis and pulmonary fibrosis at each stage in the autophagy enhanced group was reduced compared with the model group（group B）（P<0.05）（except the comparison of pulmonary fibrosis at 7th day）. Conclusion Autophagy changes in alveolar type Ⅱ epithelial cells have important regulatory effects on EMT. mTOR-siRNA can participate in the development of EMT by regulating the Smad signaling pathway and reduce the formation of pulmonary interstitial fibrosis. 　　[Key words] Interstitial lung disease; Autophagy; Alveolar type Ⅱ epithelial cells; Epithelial-mesenchymal transition（EMT）
　　間质性肺病（Interstitial lung disease，简称ILD）是一类主要累及肺脏间质，以炎症及纤维化为主的疾病，其病理基本改变是肺泡炎及肺间质纤维化，最常见的症状是渐进性呼吸困难[1]。目前而言，间质性肺炎病因复杂，机制尚未完全明了，当间质性肺病后期发展到肺纤维化后常缺乏有效的治疗办法，既往常用的抗炎、抗氧化、抗凝或扩张肺部血管药物如糖皮质激素、N-乙酰半胱氨酸、吡非尼酮、尼达尼布、西地那非和华法令等均无法从根本机制上阻止或改善损伤与修复异常[2];同时大规模临床研究也表明，这些药物不能给患者带来肺功能和生存获益，相反，部分药物甚至存在远期不良反应[3]。因此，从损伤与修复异常的调控机制入手，深入探索间质性肺纤维化中参与这一过程的重要靶点，对于寻找新的和有效的肺纤维化防治方法、改善预后将具有重要意义。
　　1 资料与方法
　　1.1 实验动物
　　从温州医科大学基础医学院实验动物中心购买8周龄、体重约25 g雄性清洁级C57BL/6 小鼠（SPF级）30只，随机分为A空白对照组、B模型组、C自噬增强组各10只，标准饲料分笼饲养，相对湿度35%～40%、室温维持在22℃～23℃、每12小时照明交替一次，各组小鼠间无饮食或饲养环境区别。处理实验小鼠的一切程序均按照《实验动物的指导意见》。
　　1.2 博莱霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化的模型建立
　　取20只小鼠腹腔注射速眠新注射液0.1 mL稀释后注射，仰卧于动物台上，2 mg/kg剂量的BLM溶于生理盐水中抽取1 mL进行快速滴注，另外空白对照组10只小鼠则给予等量生理盐水。滴毕，快速直立并旋转小鼠使药液分布均匀。
　　1.3 药物干预自噬水平变化
　　1.3.1 分组干预  自造模第2天起，每天向空白对照组小鼠（A 组）腹腔注射生理盐水1 mL;每天向模型组小鼠（B 组）腹腔内注射生理盐水 1 mL。每天向自噬增强组（C组）腹腔注射2 mg/kg的mTOR-siRNA 1 mL。各组分别于干预第7天及第14天用随机数表法随机处死3只小鼠，第28天处死剩下的4只小鼠，以干预因素和处死时间分为：空白对照7 d组（A1组），空白对照14 d组（A2组），空白对照28 d组（A3组），模型7 d组（B1组），模型14 d组（B2组），模型28 d组（B3组），自噬增强7 d组（C1组），自噬增强14 d组（C2组），自噬增强28 d组（C3组）。
　　1.3.2 siRNA慢病毒表达载体的构建  根据 Genebank序列，构建靶向 mTOR、LC3基因siRNA真核质粒表达载体并验证;利用慢病毒包装系统，构建慢病毒载体，并扩增、纯化、鉴定。
　　1.4 肺组织病理学分析
　　各组取小鼠新鲜肺组织，以20 cmH2O压力向肺组织内灌注10%中性甲醛，将肺组织置入10%中性甲醛中24 h，常规石蜡包埋和切片，行 HE染色、Masson 染色。遵循盲法原则，请我院病理专科医师按照 Ashcroft方法进行肺泡炎症及纤维化评分。
　　1.5 组织冰冻切片免疫荧光染色与TUNEL测定
　　取小鼠新鲜肺组织，OCT包埋，冰冻连续切片，贴附于聚赖氨酸包被好的载玻片上，-80℃保存待用。染色时取出，先后经 PBS、PBST漂洗后，小牛血清封闭，一抗孵育过夜，荧光二抗孵育，PBS 漂洗等过程后，以中性甘油封片，共聚焦显微镜观察并拍照。取冰冻组织切片，按照 Tunel 试剂盒（DeadEndTM Fluorometric TUNEL System，Promega，USA）说明操作。
　　1.6 透射电镜取材
　　取小鼠新鲜肺组织，取小块置于石蜡平面，滴2.5%戊二醛溶液于组织表面，快速将组织切成1 mm×1 mm×1 mm左右的小块约5～6 块，浸入2.5%戊二醛固定后送透射电镜检测。肺泡 Ⅱ型上皮细胞的判定可根据其特征性板层小体，自噬体在电镜下呈位于细胞质中的双层膜结构。
　　1.7 肺组织胶原、羟脯氨酸水平测定
　　取小鼠新鲜肺组织于液氮速冻，-80℃保存待用。测定时取出，按照 Sircol collagen assay（Biocolor，UK）、羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所）说明操作。
　　1.8 免疫组化染色（S-P 法）操作步骤
　　Smad3、Smad7免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，具体操作按照说明书进行。
　　1.9 统计学处理
　　全部统计分析计算均在Windows10 SPSS21.0软件中进行，计量资料以（x±s）表示，多组资料对比首先行正态分布检验及方差齐性检验，通过后再进行单因素方差分析。使用秩和检验进行多组等级资料统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体数量比较
　　各组分别取肺组织进行电镜检查，计数肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体数量，发现模型7 d组与空白对照7 d组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;自噬增强各组肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体数量与相应时间空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见封三图2及表1。
　　2.2 增强自噬对BLM诱导的小鼠肺间质纤维化结局的影响
　　各组小鼠28 d处死后取组织行H&E，Masson病理染色与评分。结果发现，mTOR-siRNA可减轻小鼠肺泡炎及纤维化程度。见封三图 3、4。 　　2.3 各组不同时间的肺泡炎及肺纤维化分级半定量比较
　　各时间自噬增强组和模型组与空白对照组比较均有显著性差异（aP<0.01）;自噬增强组与相应时间模型组比较P值如下，仅自噬增强7 d组与模型7 d组比较无统计学差异（dP=0.061>0.05），其他组均有统计学差异（bP<0.01，cP=0.01，eP=0.019，fP=0.012），见表2。
　　2.4 各组小鼠不同时间的肺匀浆中羟脯氨酸含量结果比较
　　各组羟脯氨酸表达与相应时间段空白对照组比较均有统计学差异（aP<0.01）;自噬增强组第7天时与模型组比较无显著性差异（bP=0.171>0.05）;第14、28天时自噬增强组较模型组升高（cP<0.01），见表3。
　　2.5 各组小鼠不同时间肺组织中 Smad3 蛋白的表达水平比较
　　各组与相应时间空白对照组Smad3 蛋白表达比较均有显著性差异（aP<0.01）;自噬增强组与模型组比较，第7天无显著性差异，第14、28天有显著性差异（bP=0.177>0.05，cP<0.01），见表4。
　　2.6 各组小鼠不同时间Smad7的表达情况比较
　　各组与相应时间空白对照组Smad7的表达水平比较均有显著性差异（aP<0.01）;自噬增强组与模型组比较第7天无显著性差异，第14、28天有显著性差异（bP=0.557，cP=0.039，dP<0.01），见表5。
　　3 讨论
　　肺间质纤维化被认为是一种异常的病理生理学进程，过多的细胞外基质导致肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤，最终引起纤维瘢痕组织形成，临床上表现为肺功能的不可逆损伤[4]。调查显示，欧洲肺间质纤维化的发病率和死亡率逐年升高，但有效的治疗方法仍较少[5]。间质性肺病治疗中以IPF（特发性肺纤维化）较为困难，因IPF 的确切病因不清，且预后极差，中位生存时间仅2～3 年，5年生存率仅20%～30%[6-7]，目前当间质性肺病后期发展到肺纤维化后缺乏有效的治疗办法且合并细菌感染预后较差[8-10]。
　　自噬是一种保护机制，LPS 可引起肺组织中某些细胞发生自噬[11]。目前已证实，自噬在心、肾、肝纤维化的发生发展具有重要意义，通过调节自噬水平变化可改变纤维化程度[12-14]。在肺动脉高压中，缺氧肺血管自噬体增多，LC3B-/-小鼠在慢性缺氧环境下肺动脉压力指数增高，提示自噬具有保护作用[15];因此我们认为，自噬在IPF 中也可能扮演重要角色。
　　肺炎上皮细胞-间充质转化（EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物学过程。目前，在乳腺癌、原发性肝癌的研究中已初步发现自噬参与调节 EMT 过程的依据[16]。目前国内外研究发现肺间质纤维化发病过程中，上皮细胞损伤导致局部组织的炎症反应和缺氧环境促使EMT发生。其中，TGF-β被认为是特发性肺纤维化中诱导EMT发生的关键因子[17]。TGF-β与上皮细胞跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ型受体结合，主要通过激活 Smad通路，使Smad2/3磷酸化并与Smad4结合进行核转位，使上皮细胞表型向间充质细胞表型转化。目前，在乳腺癌及原发性肝癌的研究中已初步发现自噬参与调节EMT过程的依据。通过饥饿诱导人肝癌细胞株HepG2、BEL7402自噬水平上调可通过TGF-β/Smad途径诱导间充质细胞标记表达增加、上皮标记表达减少，从而促进 EMT发生、肿瘤转移[18]。
　　近年来有研究证实敲除Smad3基因的小鼠和野生型小鼠采用致炎因子处理后有明显不同的肺纤维化改变及胶原蛋白沉积，提示在 TGF-β1信号传导通路调控肺纤维化发生过程中Smad3蛋白起到一部分的作用[19]，提示Smad蛋白是TGF-β1的信号转导分子和转导途径的下游转录因子，其异常表达在肺纤维化中起着关键作用[20]。TGF-β1的信号通路简单描述如下：TGF-β1首先与TGF-β1受体结合，使受体磷酸化Smad2/3，然后磷酸化的Smad2/3与Smad4结合，形成Smad2/3-Smad4二聚体进入肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞核[18]，影響有关靶点基因的表达情况。而Smad7作为TGF-β1信号传导通路中起抑制作用的蛋白，起到负反馈调节的功能[21]。
　　RNA 干扰技术通过体外合成短双链小干扰 RNA（siRNA）转入细胞，可高效、特异地抑制细胞内特定基因的表达。目前技术相当成熟，已被用于病毒性疾病、遗传性、肿瘤性疾病的治疗研究。目前针对调节自噬的药物与试剂主要有：雷帕霉素、氯喹、3-甲基腺嘌呤（3-MA）等。本研究实验结果：与模型组相比，自噬增强组第14、28天肺纤维化分级减低，结果有显著性差异（P<0.05）;根据实验结果，与模型组小鼠相比，自噬增强组（mTOR-siRNA组）羟脯氨酸含量在第14、28天时显著降低，上述结果说明mTOR-siRNA 对博来霉素所诱导的小鼠肺纤维化模型有明显抑制作用。造模成功后的模型组在第7、14、28天时的Smad3蛋白表达都较空白对照组显著升高，并呈时间依赖性，有显著性差异（P<0.01），提示 Smad3蛋白可能参与博来霉素诱导的小鼠肺纤维化过程中肺泡炎症损伤及胶原蛋白的沉积。另外我们的研究结果也显示与模型组比较，自噬增强组第14、28天的Smad3蛋白表达量均有所下降，有显著性差异（P<0.01），而自噬增强组Smad7表达量逐渐降低，第14、28天与模型组相比较具有显著性升高（P<0.05）;以上数据显示在疾病发生发展过程中伴有Smad7的低表达，解除了对TGF-β1/Smad通路中Smad3因子的抑制，而mTOR-siRNA可能通过自噬抑制Smad3高表达、同时通过促进通路中发挥负性调控作用的Smad7的高表达来进一步调控TGF-β1/Smad通路促纤维化发生的作用。本次研究仅涉及动物实验及组织学水平研究，具体机制仍有待蛋白及基因水平进一步证实。上述结果提示mTOR-siRNA能发挥抗纤维化作用与其调控Smad蛋白表达有关，可进一步用于机制研究与新药开发，为间质性肺病的治疗带来新契机。 　　[参考文献]
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　　（收稿日期：2019-04-15）
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