甘草次酸对kk-Ay糖尿病小鼠早中期肾纤维化的保护作用

来源:用户上传      作者:刘文静　南一　鲁玉梅　袁玲

　　摘要：目的 探讨甘草次酸（glycyrrhetic acid）对kk-Ay糖尿病小鼠早中期肾纤维化的保护作用，从而揭示甘草次酸通过调节肾纤维化相关蛋白的表达，延缓早中期糖尿病肾纤维化进展。方法 利用自发性KK-Ay糖尿病模型小鼠，建立预期糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）早中期肾纤维化模型（即将6周龄KK-Ay小鼠用KK专用高脂饲料饲喂6周）。再分别给予高、低浓度的甘草次酸连续灌胃干预10周。1.观察测量肾纤维化小鼠的体重、血糖变化;2.采用全自动生化分析仪检测总胆固醇（TG），甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）;3.利用光镜及透射电镜观察（TEM）肾脏组织形态、病理变化;4.采用免疫组织化学法检测Lamininl（层黏连蛋白）、E-cadherin（钙黏蛋白）、α-SMA（α-平滑肌动蛋白）肾间质纤维化指标及肾纤维化转化因子TGF-β1的表达情况。结果 与C57空白对照组小鼠比较，模型组小鼠的体重、空腹血糖明显增加（P<0.05）;血生化检测显示模型组小鼠Scr、BUN、TC、TG，LDL显著增加，HDL减小（P<0.05），而经过甘草次酸药物组干预后体重、血糖，以及Scr、BUN、TC、TG、LDL明显减轻，而HDL增加（P<0.05）。通过HE染色、Masson三色法，透射电镜显示：甘草次酸对kk-Ay糖尿病肾病小鼠早中期肾小球、肾小管及间质均有明显的修复及保护作用;免疫组化结果显示：经过甘草次酸处理后，层黏连蛋白-1、α-SMA、TGF-β1的表达降低，E-钙黏蛋白增加了（P<0.05）。结论 甘草次酸对kk-Ay糖尿病模型小鼠早中期肾纤维化具有保护作用，可能通过影响肾纤维化转化因子TGF-β1、Lamininl、E-cadherin、α-SMA纤维化相关蛋白的表达，从而延缓早中期糖尿病肾间质纤维化的进展。
　　关键词：甘草次酸; KK-Ay小鼠; EMT; Lamininl; E-cadherin; α-SMA
　　中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）03-0072-07
　　随着人们生活习惯和饮食结构的改变，糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）人数所占全球总人数比例明显呈上升趋势，继而糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）的数目也在不断地增加[1-2]。糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一，在国内也是终末期肾功能衰竭的主要原因。目前，严格控制葡萄糖和血压适用于临床实践，但治疗效果并不理想。近年来众多研究者将目光投向了传统中医药宝库，它在糖尿病肾病的治疗中起到了很好的补充作用。
　　甘草是中医治疗中最常用的草本植物，属于豆科植物。古代文献记载甘草无毒且具和百药解百毒作用，在中药处方中最为常用。现代研究表明甘草中主要的活性物质-18β-甘草次酸（GA），是甘草中的主要有效成分，是由甘草根茎中提取的五环三藉类化合物。18β-GA是具有多种药理功能的药物，具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗溃疡、抗氧化、降血脂、镇咳、改善胰岛素抵抗以及免疫调节等多种药理作用。近年来GA在肾脏相关疾病的治疗研究方面也有了很大的进展，包括对于肾脏缺血再灌注以及肾脏慢性镉中毒的保护作用。但是相关报道还是很少，因此本实验着重探讨GA对于DN动物模型的治疗效果，以期待为DN的治疗提供新的参考依据[3-5]。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料 动物：选用KK/upj-Ay/J小鼠（6周龄）SPF级，雄性75只和C57BL/6J（6周龄）SPF级，雄性对照小鼠15只，体重25±2 g，购买于北京维通利华有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004，于宁夏医科大学动物实验中心屏障内适应性饲养1周，并观察有无不良反应。饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供：普通饲料（总热能14KJ/g：蛋白质20%、脂肪8%、碳水化合物5%）;高脂饲料purina#5008（粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%），许可证号：SCXK（京）2014-0008。
　　1.2 药物制备 选用甘草次酸（glycyrrhetic acid）—18β-GA，使用前用蒸馏水配成浓度为0.36 g/mL、0.72 g/mL药物浓缩液，放置冰箱备用。
　　1.3 实验试剂 血糖试纸（德国罗氏公司，批号：06454038），磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（北京索莱宝科技有限公司），水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，国药准字号H37022673）无水乙醇（天津市化学试剂厂，批号：20060406），4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20080203）Anti-Laminin抗体（公司，批号）、Anti-E-cadherin抗体、、Anti-α-SMA抗体、Anti-TGF-β1抗体。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1 造模与分組 将6龄雄性KK-Ay小鼠30只给予KK饲料，饲养至12周龄，根据随机血糖≥13.9mmol/L测定糖尿病模型。模型建立后，随机分为4组：KK-Ay中早期糖尿病肾病模型组10只、甘草次酸组（低剂量GL：0.36 g·kg-1·d-1;高剂量GH：0.72 g·kg-1·d-1）各10只，另10只C57BL/6对照小鼠，给予普通饲料饲养。连续给药10周至小鼠达到22周龄。 　　1.4.2 小鼠体重、血糖 在固定时间每周测量小鼠的体重，然后记录求平均值。通过血糖试纸尾静脉采血法以2周的间隔测量小鼠的空腹血糖并记录。
　　1.4.3 血生化检测 在给药10周后处死所有小鼠。从腹主动脉收集血液并以3000 g/min离心15分钟。分离血清用于检测总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），尿素氮（BUN），低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）通过自动生化分析仪检测上述生化指标（BS-120，Mindary，Shenzheng）。
　　1.4.4 组织病理学（HE染色、Masson三色法、透射电镜）检测 KK-Ay小鼠給药10周后处死，并取材肾脏，将其左肾沿肾门部位纵剖为2片，二分之一肾脏放于4%多聚甲醛溶液中进行前固定，肾组织乙醇梯度脱水、透明，进口石蜡包埋，切成5μm的薄片粘附载玻片上，进行H&E、Masson染色、免疫组化，在光镜下观察肾组织病理学变化。另一片切成0.2 cm×0.1 cm大小块状，置于特殊固定液中固定供电镜用，经常规脱水、透明、树脂包埋处理后，用透射电镜观察肾组织微小结构变化。
　　1.4.5 免疫组化分析 经过脱水，脱蜡和修复抗原对肾组织切片进行封闭，然后与一抗稀释液一起孵育TGF-β1（1：100），E-钙黏蛋白（1：100）和α-SMA（1：50），层黏连蛋白-1（1：100），4°C孵育过夜然后加入二抗。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤切片并加入显色剂。最后苏木精染色以定位细胞核。
　　1.5 统计学方法 所有数据均表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 23.0通过单因素方差分析进行统计分析。当方差齐时，使用最小显著差异（LSD）测试。当方差不齐时，使用Tamhane的T2检验。P<0.05被认为具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 KK-Ay小鼠体重、血糖变化结果 在高脂高糖KK饲料诱发饲喂12周的时间，观察发现KK-Ay小鼠饮食量、尿量明显增加，毛发干枯易脱落，说明出现明显地DM症状。与C57空白组比较，模型组小鼠组体重显著增加，且差异具有统计学意义（P<0.05），与模型组组比较，KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组及KK-Ay+GL 0.36 g·kg-1组体重相对下降。（P<0.05），尤以KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组效果显著，说明：甘草次酸能改善KK-Ay小鼠的身体肥胖。见表1、图1。
　　与空白组小鼠空腹血糖相比较，KK-Ay模型组小鼠血糖升高明显，且差异具有统计学意义（P<0.05）;与KK-Ay组空腹血糖比较，KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组差异具有统计学意义（P<0.05），15周龄时，KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组，KK-Ay+GL 0.36 g·kg-1组有显著性差异，说明GH 0.72 g·kg-1组和GL 0.36 g·kg-1组能够显著改善血糖，见表2，图2。
　　2.2 血生化检测结果 C57对照组相比，模型组TG，TC和LDL脂质代谢水平显著升高（P<0.05）。HDL显著降低（P<0.05）。与模型组比较，给药组TG和TC水平均有显著变化（P<0.05）。然而，给药组的HDL和LDL变化并不明显，见表3。与对照组相比，模型组小鼠肾功指标Scr和BUN水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，治疗组水平显著下降（P<0.05）。但甘草次酸组之间的差异不显著（表4）。因此，甘草次酸可以有效改善肾功能和脂质代谢。
　　2.3 组织病理学（HE染色、Masson三色法、透射电镜）结果
　　2.3.1 HE染色 C57组大鼠肾脏组织结构未见明显改变，22周龄KK-Ay组肾组织可见肾小球体积增大，系膜基质增多，基底膜增厚，肾小管出现空泡样病变。空白组较KK-Ay模型组肾组织增生程度较轻。KK-Ay+GH 0.72 g·kg组、KK-Ay+GL 0.36 g·kg组肾组织改变较模型组组轻，见图3。
　　2.3.2 Masson三色法 与C57比较，KK-Ay组可见肾小球囊体积增大，肾小球囊壁增宽，基底膜不同程度增厚，胶原纤维染色明显，肾小管空泡样病变，肾间质胶原纤维显著增大。甘草次酸组与模型组比较，肾小球基底膜增厚程度没有KK-Ay模型组组严重，胶原纤维染色也不甚明显，肾间质胶原纤维沉积量少。给药组较模型组肾脏病理情况轻。KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组与KK-Ay+GL 0.36 g·kg组进行比较，无显著性差异。见图4。
　　3.3 透射电镜 空白组内可见毛细血管腔开放良好，内皮细胞，足细胞无异常，足突像梳子一样清晰可见，毛细血管基底膜均匀，系膜区无增生。与空白组相比，模型组肾小球基底膜上足细胞足突呈矮柱状融合、脱落，微绒毛化，基底膜变薄，系膜细胞染色质聚集，局部系膜区轻度增生，膜细胞个数大于3个;与模型组相比，甘草次酸组肾小球基底膜上足细胞足突轻度融合，基底膜轻度增厚，但厚度均匀，线粒体有损伤，基底膜上有致密物沉积，足细胞染色质边集，见图5。
　　3.4 免疫组化法检测Laminin-1、E-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白结果 与C57组相比，α-SMA、Laminin-1、TGF-β1在模型组小鼠肾小球的表达量明显增加;与模型组比较，α-SMA、Laminin-1、TGF-β1在KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组、KK-Ay+GL 0.36 g·kg组表达减少;但二者无明显差异。与C57组相比，E-cadherin蛋白在模型组KK-Ay小鼠肾小球的表达量是明显减少;与模型组比较，E-cadherin在KK-Ay+GH 0.72 g·kg-1组、KK-Ay+GL 0.36 g·kg-1组中的表达均增加，见图6～图9。 　　4 讨论
　　糖尿病发展为糖尿病肾病，并且将近一半的患者最终进展为终末期肾脏病[6]。慢性肾病（CKD）终末期肾衰竭的主要病理变化是肾间质纤维化，肾小球纤维化，肾血管纤维化和肾小管纤维化等。超过1/3的间质成纤维细胞源自肾小管上皮细胞的上皮质转化（EMT），EMT的发生是一个复杂的过程，即多种病理因素可导致肾小管上皮细胞受损。损伤的肾小管细胞或炎性细胞释放TGF-β1，诱导上皮细胞EMT变化，使上皮细胞发生获得分泌FN的间充质细胞的表型，细胞外基质（ECM）成分引起肾间质纤维化[7]。所以抑制肾小管上皮细胞分化的EMT过程是延缓DN进展的重要目标。
　　有专家认为EMT能够被划分成四个阶段：上皮细胞失去黏附能力（E-cad丢失）-重建细胞骨架蛋白肌动蛋白（a-SMA表达增多）-肾小管基底膜崩解（Laminin-1缺乏）-细胞迁移和侵袭能力增强。Laminin-1是层黏连蛋白，是细胞外基质的高分子量（400约900kDa）蛋白质。它们是基底层的主要成分，也是大多数细胞和器官的蛋白质网络基础，影响细胞分化迁移和黏附。研究表明层黏连蛋白-1上的非硫酸化HNK-1表位通常被嵌入并掩盖在坚固的基底膜中，从而与其他蛋白质紧密结合[8-11]。EMT过程还涉及到很多钙黏蛋白表达的改变，作为钙黏附蛋白家族中重要成员之一的E-cadherin具有特殊生物学活性，它不仅是一种肿瘤细胞侵袭转移抑制剂，也是主要的正常细胞生长接触抑制剂。钙黏蛋白是一类Ca2+依赖的糖蛋白，是最为经典的上皮细胞标志物。E-cad的丢失是上皮细胞转分化的标志，会进一步促进EMT的进展，E-cad与EMT过程互相影响，最终导致上皮细胞彻底转分化成纤维细胞造成肾小管间质纤维化[12-14]。a-平滑肌蛋白（a-SMA）属于6种肌动蛋白家族之一。a-SMA显著表达于发育成熟个体的血管平滑化细胞和肌性上皮细胞。a-SMA早期表达是EMT的标志物，肌成纤维细胞在肾纤维化过程中的作用主要表现在结缔组织损伤修复过程中，特异性表达a-SMA，具有极强的的收缩，增殖和分泌ECM的能力。是研究上皮细胞EMT及纤维化又一标志物[15-17]。因此，抑制肾小管EMT可以减少成纤维细胞的数量，抑制ECM（细胞外基质）的合成和分泌，为预防和治疗DN肾间质纤维化提供了新的途径。
　　笔者对18β-甘草次酸及其衍生物在糖尿病肾病纤维化可能的作用位点及信号转导通路进行实验探究，发现GA在肾脏相关疾病的治疗研究方面也有了很大的进展，包括对于肾脏缺血再灌注以及肾脏慢性镉中毒的保护作用[18，19]。如李开龙等[20]认为甘草酸可通过下调肾脏中结缔组织生长因子（TGF-β1）的表达抑制肾间质纤维化的发生，马立彬等[21]通过实验证实甘草酸二胺通过抑制TGF-β1的表达而发挥抗大鼠肾间质纤维化作用。于力[22]也證实甘草酸可以抑制细胞因子TGF-β1和基质金属蛋白酶抑制剂的表达从而改善肾小球硬化。赵海燕等[23]研究发现：18β-甘草次酸能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，改善胰岛素抵抗。王会玲等[24]通过大鼠实验对比甘草酸和泼尼松对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾脏组织病理及超微病理改变的影响，发现甘草酸和泼尼松一样具有改善马兜铃酸肾病引起的肾脏组织病理及超微结构改变且其引起体重、血压升高的副作用低于后者。Yoke Yin等[25]研究发现：给予大鼠甘草次酸100μg/g，24h后胰岛素的敏感性有所提高，降低了血糖、三酰甘油、总胆固醇。本次实验研究结果：模型组KK-Ay小鼠体重、空腹血糖明显增加，说明小鼠出现了明显的DN症状，通过HE染色、Masson染色、电镜等方法检测发现KK-Ay小鼠肾组织出现了纤维化的病理变化，经过甘草次酸长时间灌胃肾纤维化小鼠，取肾脏行HE染色观察，结果与模型组相比肾小球大小基本正常、基底膜增生明显减轻;系膜区纤维化改善，肾小管萎缩改善。说明较长时间内甘草次酸对模型小鼠肾功能及肾脏病理形态变化有影响。免疫组化显示：糖尿病小鼠肾组织中TGF-β1、a-SMA、Laminin-1蛋白呈高表达，E-cad减少，说明肾组织出现明显的纤维化。本实验研究结果与上述文献表述表述一致。
　　综上所述，长时间甘草次酸灌胃将会影响糖尿病肾病KK-Ay小鼠肾组织E-cad及a-SMA、Laminin-1蛋白的分布及含量的变化，有助于延缓DN所致的EMT肾间质纤维化的过程。由于本次实验主要是对甘草次酸的药效学进行研究，但是甘草次酸对于DN动物模型的治疗机制研究方面存在欠缺。下一步笔者将更深入的研究DN发病机制研究，以期待为DN的治疗提供新的参考依据。
　　参考文献：
　　[1]汪会琴.2型糖尿病报告发病率研究进展[J].浙江预防医学，2016，28（1）：37-39+57.
　　[2]张敏.我国糖尿病流行病学和疾病经济负担研究现状[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（56）：176.
　　[3]李小琴，沈莹，石珺.甘草次酸对糖尿病肾病动物模型的疗效观察[J].临床肾脏病杂志，2018，18（7）：434-439.
　　[4]邢燕.甘草次酸通过PI3K-AKT途径抑制H2O2所致大鼠心肌细胞氧化损伤[J].现代生物医学进展，2018，18（6）：1044-1049.
　　[5]缪雨青，周文丽，王杰军.甘草次酸及其衍生物对炎症和免疫功能影响的研究进展[J].中国中西医结合杂志，2018，38（11）：1405-1408.
　　[6]Zhang，X.Protective Effects of Berberine on Renal Injury in Streptozotocin（STZ）-Induced Diabetic Mice[J].Int J Mol Sci，2016，17（8）. 　　[7]王雅宁.黄芪甲苷抑制糖尿病肾病肾间质纤维化的作用和机制[D].2017，山东大学.
　　[8]Zhao，C.Effects of tripterygium wilfordii polyglucoside on expression of Activin A and influence of transdifferentiation in renal tubulointerstitium of rats with diabetic nephropathy[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2014，94（18）：1427-32.
　　[9]Miosge，N.，Ultrastructural colocalization of nidogen-1 and nidogen-2 with laminin-1 in murine kidney basement membranes[J].Histochem Cell Biol，2000，113（2）：115-24.
　　[10]Reuters，I.，M.Weber and E.Schulze-Lohoff，Rho/Rho kinase pathway regulates maintenance of the differentiated tubular epithelial cell phenotype on laminin-1[J].Nephron Physiol，2006，104（2）：p95-p106.
　　[11]Kizuka，Y.Laminin-1 is a novel carrier glycoprotein for the nonsulfated HNK-1 epitope in mouse kidney[J].Glycobiology，2008，18（4）：331-8.
　　[12]曾仁鳳.辛伐他汀对纤维化大鼠肺组织Snail1、E-钙粘素、波形蛋白表达的影响[D].2014，南华大学.
　　[13]尹盼盼.E-钙黏素在原发性肾病综合征患者足细胞中的表达及意义[D].中国现代医学杂志，2013，23（6）：34-38.
　　[14]季巍巍.非酒精性肝纤维化a-SMA、E-钙黏素、Twist1及TGF-β1的变化及意义[D].安徽医科大学，2012.
　　[15]陈文玲.健脾软肝方对四氯化碳致肝纤维化大鼠α-SMA及其mRNA表达的影响[J].世界中医药，2018，13（9）：2261-2267+2271.
　　[16]李光超.基于“肝肾同源”探讨DN大鼠肝中TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF在中药治疗前后的变化[J].中国中医基础医学杂志，2014，20（4）：459-461.
　　[17]陈建.抗纤灵方对AngⅡ诱导肾纤维化小鼠肾组织α-SMA和Ⅰ型胶原的影响[J].中华中医药杂志，2017，32（2）：739-742.
　　[18]吴玲玲.缝隙连接阻断剂18α-甘草次酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用[J].石河子大学学报（自然科学版），2013，31（5）：607-611.
　　[19]张小兵.长期口服18β-甘草次酸对大鼠血糖、血脂的影响[J].中医研究，2015，28（7）：48-51.
　　[20]李开龙.甘草酸18α体对梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κB表达的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2004（1）：31-33.
　　[21]马立彬.甘草酸二胺抗大鼠肾间质纤维化作用及其机制[J].华中科技大学学报（医学版），2007（6）：756-759.
　　[22]于力.甘草甜素对大鼠肾小球硬化早期的防护作用[J].中草药，2010，41（2）：250-255.
　　[23]赵海燕，王彦芳，杨少娟.18β-甘草次酸对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响[J].中国现代医学杂志，2013，23（24）：1-4.
　　[24]王会玲，张金元，黄健，甘草酸和泼尼松对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾脏组织病理及超微病理改变的影响[J].中国中西医结合杂志，2007（1）：45-49.
　　[25]Yoke，Y.C.，H.T.So and K.K.Abdul，Effects of Glycyrrhizic Acid on Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma（PPARgamma），Lipoprotein Lipase（LPL），Serum Lipid and HOMA-IR in Rats[M].PPAR Res，2010：530265.
　　（收稿日期：2019-10-29）
转载注明来源:https://www.xzbu.com/6/view-15192955.htm