灵芝多糖对脂多糖诱导的小鼠乳腺炎的保护作用

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　　摘要：灵芝多糖（GLP）是灵芝中主要功能性活性成分，具有增强免疫力、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖和降血脂等功效。采用大肠杆菌内毒素脂多糖（LPS）诱导小鼠乳腺炎，研究灵芝多糖对小鼠乳腺炎的保护作用。试验选取刚分娩的健康雌性小鼠75只，分为空白对照组、LPS组、LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组，LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组、LPS+8%GLP组分别灌胃2%、4%、8%的灵芝多糖溶液，空白对照组和LPS组灌胃等量的生理盐水。注射LPS后，测量小鼠体温变化，24 h后取乳腺制作石蜡组织切片，并测定乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性。结果表明，与空白对照组相比，LPS组小鼠体温变化显著，乳腺组织切片出现明显的中性细胞浸润现象，IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性显著上升;LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组、LPS+8%GLP组与LPS组相比，小鼠体温变化有显著改善，18 h后LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组与LPS组差异显著（P<0.05）;与LPS组相比，LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组、LPS+8%GLP组小鼠乳腺中性细胞浸润现象明显减轻，LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组的TNF-α、IL-1β含量显著低于LPS组（P<0.05）;LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组中IL-6含量显著低于LPS组（P<0.05），LPS+2% GLP组与LPS组差异不显著（P>0.05）。上述结果表明，添加4%、8%灵芝多糖可以减轻由LPS引起的小鼠乳腺炎反应。
　　关键词：小鼠;灵芝多糖;脂多糖;乳腺炎
　　中图分类号： S853.74 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0197-04
　　梁学武，教授，主要从事反刍动物营养与生产研究，E-mail：faulxw2000@163.com。 奶牛乳房炎是奶牛场常见的疾病之一，是奶牛健康养殖中极具挑战性的难题。乳腺炎是由病原微生物感染、理化因素刺激等引起的一种炎症反应。其中病原微生物感染是导致乳房炎的主要因素，研究发现，大肠杆菌是引发乳腺炎的主要环境性致病菌。脂多糖（LPS）是大肠杆菌细胞壁外膜主要成分，可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等合成和释放多种细胞因子和炎性介质，诱导乳腺炎[1-2]。奶牛乳腺炎是生产中普遍存在的问题，可造成巨大的经济损失。使用奶牛进行试验成本高，且操作复杂，小鼠具有成本低、操作简单、重复性好和易于管理等优点，因此国内外常使用小鼠作为乳腺炎研究的动物模型[3-6]。
　　临床上多采用抗生素方法治疗乳腺炎，但存在细菌产生耐药性、食品及生态安全风险等诸多弊端，且复发率较高[7]。使用抗生素防治乳腺炎风险逐渐显现，寻找新的无毒无抗、绿色安全的替代制剂越来越迫切[8]。灵芝多糖（GLP）是灵芝中重要的生物活性成分，具有增强动物机体免疫功能，提高中性粒细胞吞噬和杀菌能力的作用，同时具有降低组织损伤程度的功效[9]。本研究通过灌胃给予小鼠灵芝多糖，对小鼠乳房注射脂多糖建立乳房炎模型，通过分析表观症状和病理学表现及相关免疫因子的表达情况，研究灵芝多糖对小鼠乳腺炎的保护作用，为大肠杆菌性奶牛乳腺炎的预防研究提供理论依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　试验材料为120只雌性和30只雄性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量为18～20 g，购自福建中医药研究院。小鼠自由采食和饮水，试验温度为24±1 ℃，相对湿度为40%～80%。
　　1.2 试剂
　　灵芝多糖购自吾灵（福州）生物科技有限公司，含量为30.1%;LPS（大肠杆菌055：B5）购自西格玛化学公司。髓过氧化物酶（MPO）活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
　　1.3 小鼠分组及给药方案
　　试验用小鼠适应性饲养1周后，将雄鼠和雌鼠按1 ∶ 4比例合笼饲养，使雌鼠受孕，密切观察小鼠的生长情况，并在受孕第14天摸胎确认怀孕鼠，纳入后期试验。再选取泌乳为 1～2 d，体表健康，乳区无损伤，质量为40 g左右的初产小鼠75只。将75只小鼠均分为5组，分别为空白对照组、LPS组、LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组、LPS+8% GLP组。LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组分别灌胃 0.4 mL 2%、4%、8%的靈芝多糖溶液，空白对照组和LPS组灌胃等量的生理盐水。试验期为17 d。每天08：00灌胃1次，最后1次灌胃1 h后LPS组、LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组注射LPS溶液。注射LPS 24 h后脱颈处死小鼠。
　　1.4 乳腺炎模型
　　使用10%水合氯醛对小鼠进行腹腔麻醉，麻醉后，在第4对乳头及周围区域用75%乙醇消毒，用无菌手术剪剪除乳头1 mm左右。使用带有32 g针头的微量注射器在第4对乳头处各注射0.2 mg/mL LPS溶液50 μL。
　　1.5 样品采集与处理
　　注射LPS后，在0、6、12、18、24 h连续测定各组小鼠体温并记录。试验结束后小鼠禁食、不禁水过夜，乙醚吸入麻醉，称质量，摘眼球采集血液，测定小鼠乳腺MPO活性、TNF-α含量、IL-1β含量和IL-6含量等指标。取小鼠右侧乳腺，经4%多聚甲醛溶液固定后，制作石蜡切片，采用显微镜观察并拍照。
　　1.6 统计学处理
　　计量资料使用平均值±标准误差表示，组间比较采用单因素方差分析。
　　2 结果与分析 　　2.1 灵芝多糖对小鼠状态及体温的影响
　　如表1所示，在LPS注射6 h后，LPS组小鼠体温最低，为37.07 ℃，与其他组相比差异显著（P<0.05），LPS+GLP组小鼠体温显著低于空白对照组（P<0.05），LPS+8%组小鼠体温显著高于LPS+2%组（P<0.05），与LPS+4%组差异不显著（P>0.05）;在LPS注射后12 h时，LPS组和LPS+GLP组小鼠体温上升，LPS组和LPS+2% GLP组小鼠体温显著高于其他组（P<0.05），LPS+8% GLP组小鼠体温显著高于空白对照组（P<0.05），与GLP+4%组差异不显著（P>0.05）。在LPS注射18、24 h时，各组之间体温差异显著（P<0.05），其中LPS组小鼠体温最高，分别为39.06、39.43 ℃，空白对照组体温最低，分别为37.60、37.63 ℃。
　　2.2 小鼠乳腺组织的变化
　　如图1所示，与对照组相比，LPS组的乳腺病理变化最为严重，乳腺腺泡中呈现水肿现象，腺泡结构被严重破坏。LPS+GLP 组乳腺细胞出现中性粒细胞浸润，乳腺的病理变化较轻。组织病理学切片结果表明，灵芝多糖在一定程度上可有效缓解LPS诱发的乳腺炎。
　　2.3 灵芝多糖对LPS刺激小鼠乳腺组织中MPO活性的影响
　　如表2所示，LPS组乳腺组织中MPO活性显著高于空白对照组（P<0.05），表明LPS可成功诱导小鼠乳腺炎症。LPS+2% GLP组、LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组乳腺组织中MPO活性显著低于LPS组（P<0.05），表明灵芝多糖可以抑制小鼠乳腺组织中MPO的产生。
　　2.4 灵芝多糖对LPS刺激小鼠乳腺组织中主要炎性因子的影响
　　如表3所示，与空白对照组相比，LPS组小鼠乳腺组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高（P<0.05），LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组的TNF-α、IL-1β含量显著低于LPS组（P<0.05）;LPS+4% GLP组和LPS+8% GLP组中 IL-6含量显著低于LPS组（P<0.05），LPS+2% GLP组IL-6含量与LPS组差异不显著（P>0.05）。
　　3 讨论与结论
　　炎症是机体对各种致炎因子及局部损伤所产生的防御性反应。临床上，炎症局部可产生红、肿、热、痛及功能障碍，并伴有不同程度的全身反应。发热是LPS感染的主要反应之一，引起动物发热的致热源一般分为2类：一类是由宿主产生和释放的内源性致热源，另一类则是由微生物产生的外源性致热源[10]。研究发现，IL-1β、IL-6和TNF-α都属于内源性致热源[11]。注射LPS后， 小鼠出现精神萎靡不振、 反应迟钝、活动明显减少的表现，同时乳腺出现红肿现象，这和Roches等在奶牛上的观察结果一致[12]。小鼠感染LPS后，体温呈现出先下降后上升的趋势，总体在24 h时温度达到最高值。刘萍等的试验结果[10-11]与此相同。
　　脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁表面主要的毒力因子，是引起大肠杆菌性乳腺炎的主要原因。当LPS进入乳腺组织中时，会引起大量的中性细胞聚集。中性粒细胞的生理作用直接消灭突破了第1道免疫屏障的入侵抗原，当中性粒细胞检测到抗原或接收到来自组织细胞的信号时，便会大量流入组织[13]。进入乳腺组织中的中性粒细胞在吞噬抗原的同时，也会导致部分乳腺细胞结构出现一定程度的萎缩，甚至遭到破坏[14]。Merriman等研究发现，在乳腺炎发病期间，嗜中性粒细胞几乎占了总体细胞的90%[15]。本试验中，LPS组乳腺组织出现明显的水肿和中性粒细胞浸润现象。
　　LPS通过Toll样受体4（TLR4）传递信号，经过信号转导的方式进一步激活下游的炎症信号通路NF-κB和MAPKs，产生炎症因子、黏附分子、趋化因子、生长因子和环氧化酶等炎症介质，引发全身炎症反应[16-17]。IL-1β是白细胞介素家族的重要成员之一，可通过诱导机体释放大量炎性细胞因子来引起炎症瀑布反应[18]。TNF-α是一种高度促炎性的细胞因子，可促进内皮细胞的活化以及白细胞向感染部位的募集和活化。据报道，使用大肠杆菌感染乳腺可大大增加血液和牛奶中的TNF-α含量[19]。IL-6由2型辅助（Th2）细胞分泌，可参与先天性和获得性免疫各个方面的调节。Alhussien等使用大肠杆菌刺激乳腺，结果发现，IL-6表达量显著增加[19]。研究发现，使用LPS刺激小鼠，可使机体中的IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞炎性因子含量急剧增加[20-21]。在本研究中，LPS组小鼠体温变化明显，乳腺腺泡中呈现水肿和明显的中性细胞浸润现象，与空白对照组相比，乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性呈显著增加，表明LPS成功诱导小鼠乳腺产生炎症反应。
　　靈芝多糖（GLP）是灵芝中主要生物活性成分，具有抗菌、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血糖和降血脂等功效[22-23]。Skalicka-Wo z′niak等研究发现，灵芝多糖具有抑菌能力，对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉菌和黑根霉菌具有较高的抑制能力[24-25]。GLP对先天性和适应性免疫应答具有很强的免疫调节能力。GLP能够显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A和IL-4的分泌，缓解由葡聚糖硫酸钠（DSS）诱发的结肠炎，维持肠道的稳态[26]。余钰骢等研究发现，灵芝结构多糖水解单体GLSP1和GLSP2可以抑制LPS诱导的巨噬细胞增殖，减弱其吞噬功能，并下调LPS激活的巨噬细胞产生的NO和TNF-α的水平[27]。江国勇等在丙烯酰胺小鼠模型中，使用黑灵芝多糖灌胃小鼠，结果发现，黑灵芝多糖可显著降低小鼠肝脏中的IL-1β和IL-10水平，改善丙烯酰胺造成的肝脏损伤[28]。在本研究中，灵芝多糖通过抑制乳腺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，显示出抗炎作用。病理组织学切片观察结果表明，灵芝多糖可减轻大肠杆菌内毒素引起的病理损伤。此外，在灵芝多糖浓度为2%、4%和8%时，乳腺中的MPO活性水平显著降低。这些结果表明，灵芝多糖可缓解由大肠杆菌感染引起的乳腺炎症反应。 　　综上所述，灵芝多糖可以通过降低乳腺中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量和MPO活性，缓解小鼠乳腺炎症，特别是添加量在4%和8%时效果最佳。试验结果表明，灵芝多糖有望用作饲料添加剂，预防动物乳腺炎的发生。
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　　收稿日期：2019-10-10
　　基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目（编号：JAT160145）;福建省教育厅菌草生态产业协同创新中心项目（编号：K80ND800213）;福建农林大学科技发展资金（编号：KF2015094）。
　　作者简介：苗 景（1994—），男，河南南阳人，硕士，从事反刍动物营养研究。E-mail：hnmiaojing@126.com。
　　通信作者：林仕欣，博士，助理研究员，主要从事反刍动物营养学研究，E-mail：linshixin@fafu.edu.cn;
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