基于网络药理学探讨六味二至加味方治疗狼疮性肾炎的作用靶点分析

来源:用户上传      作者:夏杰 李松梅 马殿飞

　　摘要： 目的 通过网络药理学方法，探讨六味二至加味方治疗狼疮性肾炎的作用机理。方法 运用中药系统药理学TCMSP和ETCM数据库筛选六味二至加味方所含有效化合物，分别运用Drugbanke、Swisstarget prediction和CTD数据库获取六味二至加味方的作用靶标基因和狼疮性肾炎疾病相对应的靶标基因，将两者取交集后得到疾病-药物蛋白靶基因，利用STRING软件将构建的靶基因相互作用网络进行网络可视化展示，经网络结构和节点间加权重联系的计算分析法筛选出重要的关键基因。结果 六味二至加味方与狼疮性肾炎疾病靶标基因的交集基因有39个。结论 六味二至加味方治疗狼疮性肾炎是多靶点的复杂机制过程，其机制多与抗炎、免疫调节相关。
　　关键词： 狼疮性肾炎;六味二至加味方;网络药理学;作用靶点
　　系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，年轻中年女性多为好发群体，以20-40岁为主[1]。SLE患者几近均有肾脏损害，其多数表现为狼疮性肾炎（LN），以水肿，蛋白尿，血尿为主，甚至造成肾功能衰竭和尿毒症，LN患者生存率及生活质量不高，预后较差。中医无与狼疮性肾炎相应的名称和系统论述，中医通常认为本病病位在肾，肾虚是LN发病的内在因素[2]。孟如教授认为：狼疮性肾炎多为内外合因所致，外因为感受邪热，郁久成毒，进而内舍五脏六腑。基于“肝肾同源”的理论，采用滋肾养阴活血法，从肝肾论治，创制六味二至加味方。该方是孟如教授四十余年对中医风湿免疫理论深入探讨及临床研究而形成的经验方，临床研究表明六味二至加味方治疗LN具有显著的临床疗效[3-4]。
　　目前，动物、细胞和分子实验虽可对某一机制进行研究，但难以揭示复方中药分子机制系统性。随着生物信息学的迅速发展，采用多成分、多靶点的思路阐明了药物发挥作用多层次网络结构[5]。基于此，本文通过网络药理学初步挖掘中药复方六味二至加味方治疗LN的分子机制，预测潜在靶点及相关疾病信息，为开展实验验证提供参考依据。
　　1 研究方法
　　1.1 六味二至加味方所含化合物的收集与筛选 将六味二至加味方组成生地黄、山茱萸，山药，茯苓，丹参等11 味中药分别输入中药系统药理学数据库（TCMSP，ETCM）[6]，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）设置为≥30%，类药性指数（drug like index，DL）设置为≥0.10，查询并筛选该数据库中所包含的上述11味中藥的有效活性成分，ETCM中所搜集的成分保留Druglikeness Grading 为Moderate和Good。将两个数据库所筛选保留下来的成分，进一步根据筛选先导化合物的原则：分子质量MW在100-380之间，脂水分配系数的对数值在0-3，氢键供体≤5，氢键受体≤10，筛选出药代动力学特性和成药性较优的活性成分。
　　1.2 六味二至加味方作用靶点预测[7] 药物分子与特定的靶点相结合，通过调节其生物活性及转录水平发挥作用。为了阐明药物的作用机制，收集化合物作用靶点，对1.1中筛选的活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行SMILE结构式转换后导入Swisstargetpredicti-ion（http：//www.swisstargetpredict-ion.ch）数据库预测活性成分的靶点。
　　1.3 六味二至加味方有效化合物与其作用靶点相互作用的网络构建 为了阐明六味二至加味方治疗LN的制，本研究采用cytoscape3.6.0软件[8]构建六味二至加味方活性成分-作用靶点网络关系图，该网络中，化合物和靶点以节点表示，2个节点间相互作用由边表示，每个节点的重要性通过拓扑参数度数进行评估，度数越大，说明与该节点相关的节点数越多，则该节点越重要。节点度数由Cytoscape插件Network Analyzer 进行分析。根据Degree分析结果，保留Degree≥10的靶点和成分，作为复方的核心成分和关键靶点。
　　1.4 LN发病靶点检索及六味二至加味方作用LN相关靶点的预测[9-11] 在CTD数据库（http：//ctdbase.org/）及Disgenet数据（https：//www.disgenet.org）中以Lupus Nephritis为关键词搜索LN疾病相关靶点。本研究取两个数据库共有靶点进行后续分析研究。将六味二至加味方作用靶点与疾病靶点导入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）软件，得到交集靶点，即六味二至加味方作用LN的靶点。
　　1.5 六味二至加味方对LN作用靶点的PPI网络构建 为了获得六味二至加味方对LN作用靶点之间的联系，将六味二至加味方对LN的靶点上传至STRING 10.5 数据库（https：//string-db.org）[12]，选择研究人类物种，设置靶点之间最低要求联系分数为0.4，并隐藏不与其他靶点联系的靶点，得到靶点联系网络图。将该图导入Cytoscape 3.7.0软件进行拓扑学分析并构建PPI 网络。
　　2 结果与分析
　　2.1 六味二至加味方所含化合物的收集与筛选结果 筛选出六味二至加味方的活性化合物共108个，其中地黄有效成分1个，山茱萸16个，山药9个，茯苓1个，泽泻11个，牡丹皮8个，小蓟3个，益母草12个，丹参33个，墨旱莲11个，女贞子3个。
　　2.2 六味二至加味方有效化合物作用LN 相关靶点预测及成分靶点网络构建结果 2.1中82个化合物共检索出2137 个预测靶点，同时构建C-T图，根据Degree分析结果，保留Degree≥10的靶点和成分，作为复方的核心成分和关键靶点，共167个，其中化合物毛地黄黄酮（网络节点度=19），四氢鸭脚木碱（网络节点度=19），二氫丹參内酯（网络节点度=18），海风藤酮（网络节点度=18），山柰酚（网络节点度=17），异鼠李素（（网络节点度=16），丹参新醌D（网络节点度=13），将每个化合物与其作用的LN靶点相联系，通过Cytoscape 3.7.0 软件做出化合物-靶点联系图（见图1）。运用软件中自带的NetworkAnalyzer 插件分析网络节点度（degree）。越高的数值说明其相对应的化合物、靶点在网络中越关键。表明它们是六味二至加味方治疗LN的主要有效化合物和靶点。 　　2.3 LN相关靶点检索及六味二至加味方作用LN 相关靶点的预测结果 通过CTD（http：//ctdbase.org/）、Disgenet（https：//www.uniprot.org/ database /DB-0218）数据库，得分≥ 10 分的靶点共检索出696个与LN 相关的靶点，将六味二至加味方82个有效化合物所对应的167 个预测靶点与696 个LN 相关靶点导入VENNY（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）软件，共得到39 个共同靶点，即六味二至加味方作用LN 的靶点，见图2。
　　2.4 六味二至加味方对LN 作用靶点的PPI 网络构建结果 根据1.5 中要求，STRING10.5（https：//string-db.org）数据库获得39 个靶点之间共407条联系的网络图。将图导入Cytoscape 3.6.1 软件进行拓扑学分析，获得联系其他靶点个数排名前6 位的靶点依次是VEGFA（36 个）、TNF（32 个）、IL6（34 个）、IL10（33 个）、STAT3（33 个）、CXCL8（32 个）。六味二至加味方对LN作用靶点的PPI 网络图，见图3。
　　3 讨论
　　六味二至加味方源自《金匮要略》所载之“崔氏八味丸”（仲景易名曰肾气丸）减去桂枝、附子而成的六味地黄丸合《太平惠民和剂局方》中的二至丸化裁加味而来，二方合用滋补肝肾之功增强。此外，孟如教授指出，本病热毒阻滞，气滞血瘀，故在狼疮性肾炎的治疗过程中，活血化瘀法要贯穿始终。网络药理学基于多靶点的研究思路，为我们提供了复方中药新的策略。本研究借助网络药理学手段，初步挖掘、分析六味二至加味方治疗 LN 的可能作用机制。
　　本研究结果显示，六味二至加味方和LN的交集靶基因共39个，进一步提炼出六味二至加味方治疗LN的生物学功能。研究表明[14-18]，TNF（肿瘤坏死因子）作为自身免疫炎症反应过程中的关键因子，在SLE患者的血清中，sTNFRs、TNF-α这两项指标的表达水平均高于健康人时，SLE发病几率增大。VEGFA（血管内皮生长因子A）能发挥诱使内皮细胞增殖、迁移及抑制凋亡的作用，研究表明，LN患者的血清中的VEGF水平明显高于未患病对照组，推导VEGF水平很可能收到刺激而升高表达水平，从而在LN中发挥作用。mTOC在以下生化反应中起至关重要的作用：自噬、调控免疫分化、氧化应激过程及炎性因子分泌，若mTOC被阻断，有利于LN患者病情的控制。作为抗原递呈细胞和T细胞有效抑制因子之一IL-10，不仅能抑制单个核细胞而分泌前炎症因子，还能抑制丝裂原诱导的T细胞增殖反应，因IL10分泌量的增加，可以相對阐明SLE疾病免疫调节的紊乱状态。IL-6可以刺激诱导T细胞和B细胞的增殖。IL-6在CRP调节方面发挥至关重要的作用，IL-6通过与IL-R6结合，能够促使B细胞分泌抗双链DNA和IgG抗体，诱发肾小球内的炎症反应，从而诱导系膜细胞增殖和收缩以及肾小球的血流量减少甚至加重其缺血和缺氧量，进一步损害肾小球上皮细胞和系膜细胞。 通过研究LN小鼠发现，在其肾组织中p-STAT3 蛋白和mRNA的表达水平显著高于同等条件下无肾组织损害的对照C57BL/6小鼠;同时，通过免疫组化的结果得出，BXSB小鼠肾组织细胞核是STAT1/3表达的场所，提示STAT1/3被活化。
　　综上所述，六味二至加味方可能经炎症、细胞增殖及免疫因子信号通路等作用于LN，它是一种多个靶点的复杂的生理机制过程，本研究为阐明药物-靶点之间相互作用机制提供了重要参考信息，同时也为中医药治疗狼疮性肾炎提供了作用机制研究方面的思路。
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　　（收稿日期：2020-03-11）
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